In Situ Microscopia per la determinazione in tempo reale della morfologia a singola cellula nei bioprocessi

Sommario

È stato sviluppato un dispositivo di microscopia foto-ottica in situ per monitorare le dimensioni delle singole cellule direttamente nella sospensione cellulare. La misurazione in tempo reale viene effettuata accolando la sonda sterilizzabile fotoottica a un'analisi automatizzata delle immagini. I cambiamenti morfologici compaiono con dipendenza dallo stato di crescita e dalle condizioni di coltivazione.

Abstract

Il monitoraggio in situ nei bioprocessi microbici è per lo più limitato alle proprietà chimiche e fisiche del mezzo(ad esempio,il valore di pH e la concentrazione di ossigeno disciolto). Tuttavia, la morfologia delle cellule può essere un indicatore adatto per condizioni ottimali, poiché cambia con la dipendenza dallo stato di crescita, l'accumulo di prodotto e lo stress cellulare. Inoltre, la distribuzione delle dimensioni delle singole cellule fornisce non solo informazioni sulle condizioni di coltivazione, ma anche sull'eterogeneità della popolazione. Per ottenere tali informazioni, è stato sviluppato un dispositivo di microscopia in situ foto-ottico¹ per consentire il monitoraggio della distribuzione delle dimensioni delle singole cellule direttamente nelle sospensioni cellulari nei bioreattori. Un'analisi automatizzata delle immagini viene accoppiata alla microscopia basata su un modello di rete neurale, sottoposto a training con immagini con annotato dall'utente. Diversi parametri, che si ottengono dalle catture del microscopio, sono correlati per elaborare le caratteristiche rilevanti delle cellule, come la loro attività metabolica. Fino ad ora, la serie di sonde di microscopia in situ è stata applicata per misurare la dimensione del pellet nelle sospensioni filamentose dei funghi. È stato utilizzato per distinguere le dimensioni delle singole cellule nella coltivazione delle microalghe e metterle in relazione con l'accumulo di lipidi. La forma delle particelle cellulari era correlata al germogliamento nelle colture di lievito. L'analisi della microscopia può essere generalmente suddivisa in tre fasi: (i) acquisizione di immagini, (ii) identificazione delle particelle e (iii) analisi dei dati, rispettivamente. Tutte le misure devono essere adattate all'organismo, e quindi sono necessarie informazioni specifiche con annotato per ottenere risultati affidabili. La capacità di monitorare i cambiamenti nella morfologia cellulare direttamente in linea o on line (in un by-pass) consente valori in tempo reale per il monitoraggio e il controllo, nello sviluppo dei processi e nella scala di produzione. Se i dati off line sono correlati ai dati in tempo reale, le misurazioni off line correnti con influenze sconosciute sulla dimensione della cellula diventano inutili.

Introduzione

Le caratteristiche morfologiche delle cellule sono spesso legate allo stato fisiologico, esiste una connessione tra forma e funzione per molte applicazioni. La morfologia di una singola cellula è influenzata dallo stato di crescita, dall'età della cellula, dalle sollecitazioni osmotiche e da altre potenziali sollecitazioni cellulari o dall'accumulo di prodotti. I cambiamenti morfologici delle cellule sono spesso una misura della vitalità di crescita di una cultura. Sintesi del prodotto intracellulare, accumulo di lipidi nelle alghe e formazione del corpo di inclusione nei batteri, tra gli altri, sono correlati con la dimensione della cellula pure. L'agglomerazione cel....

Protocollo

NOTA: I seguenti passaggi sono necessari per adattare i parametri alle rispettive condizioni di microrganismo e coltura. La regolazione delle impostazioni della sonda dura circa 20 min per un utente esperto. Una descrizione dettagliata degli strumenti e dei passaggi è fornita nel manuale della sonda corrispondente di SOPAT GmbH. In generale, gli strumenti che sono presentati nel seguente protocollo sono necessari: (i) Probe Controller per le regolazioni probe e l'acquisizione dell'immagine; (ii) Figi (ImageJ) per le annotazioni sulle immagini acquisite; (iii) Supporto SOPAT per la formazione della rete neurale artificiale (ANN) e la creazion....

Risultati

Il rilevamento delle dimensioni delle cellule nelle colture di lievito con l'ISM e il rilevamento automatico delle immagini per distinguere tra cellule in erba e non in erba è stato condotto con successo. Sia l'intensità dello stroboscopio che la scelta del divario di misurazione hanno una gamma di tolleranza, in cui l'identificazione delle particelle non è influenzata. Ad esempio, le cellule di S. cerevisiae sono state misurate con varie intensità dello stroboscopio all'interno .......

Discussione

ISM come presentato qui con lo stesso o molto simili dispositivi è stato utilizzato per misurare la dinamica morfologica di funghi, microalghe e lieviti, che ha permesso la determinazione dell'attività di crescita, e in caso di alghe, l'accumulo di prodotti intracellulari. Il sensore non ha parti mobili ed è direttamente applicabile in qualsiasi bioreattore di serbatoio agitato standard, sia attraverso una porta standard o in un by-pass sterilizzabile. Poiché il lievito è molto più piccolo delle alghe, la riduzione delle.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sensore MM 2.1 - MFC	SOPAT GmbH, Germania	n.a.Sonda	microscopica monoculare in linea Versione 2.1 con una cella di flusso Mirco
Sofware versione v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germania	n.a.Misuratore
spessore	n.n.Può		essere qualsiasi fornitore, DIN 2275:2014-03
Etanolo 70%	n.n.Può		essere qualsiasi fornitore
SOPAT versione manuale 2.0.5	SOPAT GmbH, Germania
Carta per lenti ottiche	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	provette
da 50 ml	Può essere qualsiasi fornitore

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