Vi udviklede en heterogen bryst kræft model bestående af udødeliggjort tumor og fibroblast celler indlejret i en bioprintable calciumalginat/gelatine bioink. Modellen sammenfatter i vivo tumor mikromiljø og letter dannelsen af flercellede tumor spheroids, giver indsigt i de mekanismer, der driver tumordannelse.
Den cellulære, biokemiske og biofysiske heterogenitet af indfødte tumor mikromiljø er ikke sammenfattet af voksende udødeliggjort kræft cellelinjer ved hjælp af konventionelle todimensionale (2D) cellekultur. Disse udfordringer kan overvindes ved hjælp af bioprinting teknikker til at bygge heterogene tredimensionale (3D) tumor modeller hvor forskellige typer af celler er integreret. Calciumalginat og gelatine er to af de mest almindelige biomaterialer ansat i bioprinting på grund af deres biokompatibilitet, Biomimetik og mekaniske egenskaber. Ved at kombinere de to polymerer, opnåede vi en bioprintable sammensatte hydrogel med ligheder til den mikroskopiske arkitektur i en native tumor stroma. Vi studerede trykproces sammensatte hydrogel via reologi og opnået den optimale udskrivning vindue. Brystkræftceller og fibroblaster var indlejret i hydrogels og udskrives til at danne en 3D-model efterligne i vivo mikromiljø. Bioprinted heterogen model opnår en høj rentabilitet for langsigtet cellekultur (> 30 dage) og fremmer den samlesæt af brystkræftceller i flercellede tumor spheroids (MCTS). Vi observerede migration og interaktion af kræft-associerede fibroblastceller (cafïr) med MCTS i denne model. Ved hjælp af bioprinted celle kultur platforme som fælles kultur systemer, tilbyder det et unikt værktøj til at studere afhængighed af tumordannelse stroma sammensætning. Denne teknik har en høj overførselshastighed, lave omkostninger og høj reproducerbarhed, og det kan også give en alternativ model til konventionelle éncellelag cellekulturer og animalske tumor modeller at studere kræft biologi.
Selvom 2D cellekultur er meget udbredt i kræftforskning, findes begrænsninger som celler dyrkes i et éncellelag format med en ensartet koncentrationen af næringsstoffer og ilt. Disse kulturer mangler vigtige celle-celle og celle-matrix interaktioner i native tumor mikromiljø (TME). Derfor, disse modeller dårligt sammenfatte fysiologiske forhold, hvilket resulterer i afvigende celle adfærd, herunder unaturlige morfologier, uregelmæssige receptor organisation, membran polarisering og unormale Gen-ekspression, blandt andet betingelser1,2,3,4. På den anden side tilbyder 3D cellekultur, hvor celler er udvidet i en målekolbe plads som aggregater, spheroids eller organoids, en alternativ teknik for at skabe mere præcise in vitro- miljøer for at studere grundlæggende cellebiologi og fysiologi. 3D celle kultur modeller kan også fremme celle-ECM interaktioner, der er kritiske fysiologiske egenskaber af indfødte TME in vitro-1,4,5. Den nye 3D bioprinting-teknologi giver muligheder for at bygge modeller, der efterligner den heterogene TME.
3D bioprinting er afledt af rapid prototyping og giver mulighed for fremstilling af 3D mikrostrukturer, der er i stand til at efterligne nogle af kompleksiteten af levende væv prøver6,7. De nuværende bioprinting metoder omfatter inkjet, ekstrudering og laser-assisteret udskrivning8. Blandt dem giver metoden ekstrudering heterogenitet skal kontrolleres inden for de trykte matricer af præcis positionering forskellige typer af materialer på forskellige oprindelige placeringer. Det er derfor, den bedste fremgangsmåde til at fabrikere heterogene in vitro- modeller som omfatter flere typer af celler eller matricer. Ekstrudering bioprinting har held været anvendt til at opbygge auricular formet stilladser9, vaskulære strukturer10,11,12, og huden væv13, hvilket resulterer i høje udskrivning troskab og celle levedygtighed. Teknologien er også udstyret med alsidigt materiale valg, evnen til at deponere materialer med celler indlejret med en kendt tæthed, og høj reproducerbarhed14,15,16,17 . Naturlige og syntetiske hydrogels er ofte brugt som bioinks for 3D bioprinting på grund af deres biokompatibilitet, bioactivity og deres hydrofile netværk, der kan blive manipuleret til at strukturelt ligner ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels er også fordelagtigt, da de kan indeholde klæbende websteder for celler, strukturelle elementer, permeabilitet for næringsstoffer og luftarter, og de relevante mekaniske egenskaber til at fremme celle udvikling24. For eksempel tilbyder kollagen hydrogels integrin anchorage websteder, at celler kan bruge til at knytte til matrixen. Gelatine, denatureret kollagen, bevarer lignende celle vedhæftning websteder. Derimod calciumalginat bioinert men giver mekaniske integritet ved at danne krydsbindinger med divalent ioner25,26,27,28.
I dette arbejde udviklet vi et komposit hydrogel som en bioink, bestående af natriumalginat og gelatine, med ligheder til den mikroskopiske arkitektur i en native tumor stroma. Brystkræftceller og fibroblaster var indlejret i hydrogels og udskrives via en ekstrudering-baserede bioprinter for at oprette en 3D-model, der efterligner i vivo mikromiljø. Manipuleret 3D miljø tillader kræftceller til at danne flercellede tumor spheroids (MCTS) med en høj rentabilitet i lange perioder af cellekultur (> 30 dage). Denne protokol viser metoder for syntese sammensatte hydrogels, kendetegner materialer mikrostruktur og trykproces, bioprinting cellular heterogene modeller, og observere dannelsen af MCTS. Disse metoder kan anvendes til andre bioinks i ekstrudering bioprinting samt om forskellige designs heterogent væv modeller med potentielle anvendelser i stof screening, celle migration assays og undersøgelser, der fokuserer på grundlæggende celle fysiologiske funktioner.
Celle-belæsset strukturer kan blive kompromitteret, hvis forurening (biologiske eller kemiske) opstår på ethvert tidspunkt i processen. Normalt, biologisk forurening er set efter to eller tre dage af kulturen som en farve ændring i kultur medier eller bioprinted struktur. Derfor, sterilisation (fysisk og kemisk desinfektion) er et afgørende skridt for alle de celle-relaterede processer. Bemærkelsesværdigt, autoklavering gelatine ændrer sin geldannende egenskaber, som gjorde det gel langsommere i de forsøg, vi ha…
The authors have nothing to disclose.
Tao Jiang tak Kina stipendium Rådet (201403170354) og McGill Engineering ph.d.-bedømmelse (90025) for deres stipendium midler. Jose G. Munguia-Lopez tak CONACYT (250279, 290936 og 291168) og FRQNT (258421) for deres stipendium midler. Salvador Flores-Torres tak CONACYT for deres stipendium midler (751540). Joseph M. Kinsella tak National Science og Engineering Research Council, den canadiske Foundation for Innovation, Townshend-Malene Stevnsbo Family Foundation og McGill University for deres finansiering. Vi vil gerne takke Allen Ehrlicher for at lade os bruge hans rheometer, Dan Nicolau for at lade os bruge hans Konfokal mikroskop, og Morag Park for at give os adgang til fluorescently mærket cellelinjer.
Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
MilliQ water | Millipore | N/A | |
Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
Water bath | VWR | N/A | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |