Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella
Summary
Abbiamo sviluppato un modello di cancro al seno eterogeneo costituito da cellule del tumore e del fibroblasto immortalate incorporate in un bioink di alginato/gelatina bioprintable. Il modello ricapitola il microambiente tumorale in vivo e facilita la formazione di sferoidi multicellulari tumore, producendo la comprensione dei meccanismi di tumorigenesi di guida.
Abstract
L’eterogeneità di cellulare, biochimico e biofisico del microambiente tumorale nativo non è ricapitolata dalla crescente linee cellulari di cancro immortalizzate mediante coltura convenzionale cellulare bidimensionale (2D). Queste sfide possono essere superate utilizzando tecniche multimateriali per costruire modelli eterogenei tridimensionale (3D) del tumore per cui sono incorporati diversi tipi di cellule. Alginato e gelatina sono due dei più comuni biomateriali impiegati in multimateriali dovuto la loro biocompatibilità, biomimicry e proprietà meccaniche. Combinando i due polimeri, abbiamo raggiunto un idrogel composito bioprintable con analogie con l’architettura microscopica di stroma del tumore nativo. Abbiamo studiato la stampabilità di idrogel composito tramite reologia ed abbiamo ottenuto la finestra di stampa ottima. Fibroblasti e cellule di cancro al seno sono stati incorporati nel caso degli idrogeli e stampati per formare un modello 3D che imita il microambiente in vivo . Il modello eterogeneo di bioprinted raggiunge un’alta redditività per colture cellulari a lungo termine (> 30 giorni) e promuove l’auto-assemblaggio delle cellule di cancro al seno in sferoidi multicellulari tumore (MCTS). Abbiamo osservato la migrazione e l’interazione delle cellule del cancro-collegata del fibroblasto (CAFs) con il MCTS in questo modello. Utilizzando piattaforme di cultura cellulare bioprinted come sistemi di co-coltura, offre uno strumento unico per studiare la dipendenza della tumorigenesi sulla composizione dello stroma. Questa tecnica presenta un alto-rendimento, basso costo e alta riproducibilità, e può anche fornire un modello alternativo per colture monostrato cellulare convenzionale e modelli animali del tumore per lo studio di biologia del cancro.
Introduction
Anche se la coltura delle cellule 2D è ampiamente usato nella ricerca sul cancro, esistono limitazioni come le cellule sono coltivate in un formato monostrato con una concentrazione uniforme di nutrienti e ossigeno. Queste culture mancano importante cellula-cellula e delle interazioni cellula-matrice presentano nel microambiente tumorale nativo (TME). Di conseguenza, questi modelli ricapitolano mal condizioni fisiologiche, conseguente a comportamenti aberrante delle cellule, tra cui morfologie innaturale, recettore irregolare organizzazione, polarizzazione di membrana ed espressione genica anormale, tra l’altro condizioni1,2,3,4. D’altra parte, coltura cellulare 3D, dove le cellule vengono espansi in uno spazio volumetrico come aggregati, sferoidi o organoids, offre una tecnica alternativa per creare ambienti più accurati in vitro per studiare la fisiologia e biologia delle cellule fondamentali. Modelli di coltura cellulare 3D possono anche incoraggiare interazioni cellula-ECM che sono critiche caratteristiche fisiologiche del nativo TME in vitro1,4,5. L’emergente tecnologia 3D multimateriali fornisce possibilità per costruire modelli che simulano la TME eterogenei.
3D multimateriali deriva dalla prototipazione rapida e consente la fabbricazione di microstrutture 3D che sono in grado di alcune delle complessità della vita che imita tessuto campioni6,7. Gli attuali metodi di multimateriali includono estrusione, inkjet e laser-assistita stampa8. Fra loro, il metodo di estrusione consente l’eterogeneità essere controllata all’interno delle matrici stampate posizionando precisamente distinti tipi di materiali in diverse posizioni iniziali. Pertanto, è l’approccio migliore per fabbricare modelli eterogenei in vitro che coinvolgono più tipi di cellule o matrici. Multimateriali di estrusione sono stato utilizzato con successo per costruire auricolari sagomati ponteggi9, strutture vascolari10,11,12e della pelle tessuti13, risultante nella cella e stampa ad alta fedeltà vitalità. La tecnologia dispone anche di selezioni di materiali versatili, la possibilità di depositare materiali con cellule incorporate con una densità nota e alta riproducibilità14,15,16,17 . Idrogeli naturali e sintetici vengono spesso utilizzati come bioinks per 3D multimateriali dovuto la loro biocompatibilità, bioattività e loro reti idrofili che possono essere progettati per assomigliare strutturalmente l’ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Idrogeli sono inoltre vantaggiosi poiché possono includere siti adesivi per cellule, elementi strutturali, permeabilità per le sostanze nutrienti e gas, e le proprietà meccaniche appropriate per incoraggiare lo sviluppo24di cella. Per esempio, collagene idrogel offrono integrina siti di ancoraggio che le cellule possono utilizzare per collegare alla matrice. Gelatina, collagene denaturato, mantiene simili siti di adesione cellulare. Al contrario, alginato è bioinerte ma fornisce integrità meccanica formando legami incrociati con gli ioni bivalenti25,26,27,28.
In questo lavoro, abbiamo sviluppato un composito idrogel come un bioink, composto di alginato e gelatina, con analogie con l’architettura microscopica di stroma del tumore nativo. Fibroblasti e cellule di cancro al seno sono stati incorporati nel caso degli idrogeli e stampato tramite un bioprinter basato su estrusione per creare un modello 3D che imita il microambiente in vivo . L’ambiente 3D derivati dal permette alle cellule tumorali di formare sferoidi multicellulari tumore (MCTS) con un alta attuabilità per lunghi periodi di coltura delle cellule (> 30 giorni). Questo protocollo viene illustrato le metodologie di sintesi di idrogeli compositi, che caratterizzano la microstruttura dei materiali e la stampabilità, modelli eterogenei cellulari multimateriali e osservare la formazione di MCTS. Queste metodologie possono essere applicate ad altri bioinks in estrusione multimateriali pure per quanto riguarda diversi disegni di modelli di tessuto eterogeneo con potenziali applicazioni in screening di farmaci, analisi di migrazione delle cellule e gli studi che si concentrano sulla cellula fondamentale funzioni fisiologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cella-carichi strutture possono essere compromessa in caso di contaminazione (biologico o chimico) in qualsiasi punto nel processo. Di solito, contaminazione biologica è visto dopo due o tre giorni di cultura come un colore cambiare in terreni di coltura o la struttura di bioprinted. Di conseguenza, la sterilizzazione (disinfezione chimica e fisica) è un passo fondamentale per tutti i processi di cella. Degno di nota, gelatina di sterilizzazione in autoclave cambia le proprietà gelificanti, che ha reso più lento del …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tao Jiang grazie la Cina Scholarship Council (201403170354) e McGill Engineering Award dottorato (90025) per il loro finanziamento di borse di studio. Jose G. Munguia-Lopez grazie CONACYT (250279, 290936 e 291168) e FRQNT (258421) per il loro finanziamento di borse di studio. Salvador Flores-Torres grazie CONACYT per loro borsa di studio (751540) di finanziamento. Joseph M. Kinsella grazie della National Science ed Engineering Research Council, la Fondazione canadese per l’innovazione, Townshend-Lamarre Family Foundation e McGill University per il loro finanziamento. Vorremmo ringraziare Allen Ehrlicher per averci permesso di utilizzare il suo reometro, Dan Nicolau per averci permesso di usare il suo microscopio confocale e Morag Park noi dell’accesso alle linee cellulari fluorescente contrassegnati.
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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