Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystemer indusere celle-formet formasjon
Summary
Vi utviklet en heterogen bryst kreft modell består av udødeliggjort svulst og fibroblast celler i en bioprintable alginate/gelatin bioink. Modellen viser i vivo svulst microenvironment og forenkler dannelsen av flercellet svulst spheroids, gir innsikt i mekanismer kjøring tumorigenesis.
Abstract
Den cellulære biokjemiske og Biofysiske heterogeniteten opprinnelige svulsten microenvironment er ikke recapitulated av voksende udødeliggjort kreftcelle linjer med konvensjonelle todimensjonal (2D) cellekultur. Disse utfordringene kan overvinnes ved å bruke bioprinting teknikker for å bygge heterogene tredimensjonale (3D) svulst modeller der ulike typer celler er innebygd. Alginate og gelatin er to av de vanligste biologisk materiale i bioprinting deres biocompatibility, biomimicry og mekaniske egenskaper. Ved å kombinere de to polymerer, oppnådd vi en bioprintable sammensatte hydrogel med likheter til en innfødt svulst stroma mikroskopiske arkitektur. Vi studerte om utskrift er mulig til sammensatte hydrogel via Reologi og fått vinduet for optimal utskrift. Brystkreft celler og fibroblaster var innebygd i hydrogels og utskrift for å danne en 3D-modell mimicking i vivo microenvironment. Bioprinted heterogene modellen oppnår en høy levedyktighet for langsiktig cellekultur (> 30 dager) og fremmer den selv-montering av brystkreft celler i flercellet svulst spheroids (MCTS). Vi observerte migrasjon og samspillet av kreft-assosiert fibroblast cellene (CAFs) med MCTS i denne modellen. Ved å bruke bioprinted celle kultur plattformer som co kultur systemer, tilbyr et unikt verktøy for å studere avhengigheten av tumorigenesis stroma sammensetningen. Denne teknikken har en høy gjennomstrømning og lav pris og høy reproduserbarhet, og det kan også gi en alternativ modell til konvensjonelle monolayer cellekulturer og dyr svulst modeller å studere kreft biologi.
Introduction
Selv om 2D cellekultur brukes mye i kreftforskning, finnes begrensninger som cellene er dyrket i et monolayer format med en ensartet konsentrasjon av næringsstoffer og oksygen. Disse kulturene mangler viktige celle-celle, og cellen matrise interaksjoner stede i den opprinnelige svulsten microenvironment (TME). Derfor recapitulate disse modellene dårlig fysiologiske forhold, noe som resulterer i avvikende celle atferd, inkludert unaturlig morphologies, uregelmessig reseptor organisasjon, membran polarisering og unormale genuttrykk, blant annet forhold1,2,3,4. På den annen side, tilbyr 3D cellekultur, der celler er utvidet i løpet volumetriske aggregat, spheroids eller organoids, en alternativ teknikk for å skape mer nøyaktig i vitro miljøer for å studere grunnleggende cellebiologi og fysiologi. 3D celle kultur modeller kan også oppfordre celle-ECM interaksjoner som er kritiske fysiologiske egenskaper av innfødte TME i vitro1,4,5. Den nye 3D bioprinting-teknologien gir muligheter til å bygge modeller som etterligner den heterogene TME.
3D bioprinting er avledet fra rapid prototyping og gjør fabrikasjon av 3D microstructures som er i stand til å etterlikne noen av kompleksiteten av levende vev prøver6,7. Gjeldende bioprinting metoder omfatter inkjet, ekstrudering og laser-assistert utskrift8. Blant dem kan metoden ekstrudering heterogenitet skal kontrolleres i de utskrevne matriser av nøyaktig posisjonering forskjellige typer materialer på ulike første steder. Det er derfor den beste måten å dikte heterogene i vitro modeller som involverer flere typer celler eller matriser. Ekstrudering bioprinting har blitt brukt til å bygge auricular formet stillaser9, vaskulære strukturer10,11,12, og huden vev13, som resulterer i høy utskrift gjengivelse og celle levedyktighet. Teknologien har også allsidig materielle valg, muligheten til å sette inn materialer med celler innebygd med kjente tetthet og høy reproduserbarhet14,15,16,17 . Naturlige og syntetiske hydrogels brukes ofte som bioinks for 3D bioprinting deres biocompatibility, bioactivity og hydrofile nettverket som kan bli konstruert å strukturelt ligner ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels er også en fordel siden de kan inneholde lim nettsteder for celler, strukturelle elementer, permeabilitet for næringsstoffer og gasser, og de aktuelle mekaniske egenskapene å oppmuntre celle utvikling24. For eksempel tilbyr kollagen hydrogels integrin anchorage nettsteder celler kan bruke til å legge til matrisen. Gelatin, denaturert kollagen, beholder samme celle vedheft nettsteder. I kontrast, alginate er bioinert, men gir mekanisk integritet ved å danne krysskoblinger med divalent ioner25,26,27,28.
I dette arbeidet utviklet vi et sammensatt hydrogel som en bioink, alginate og gelatin, med likhetstrekk til en innfødt svulst stroma mikroskopiske arkitektur. Brystkreft celler og fibroblaster var innebygd i hydrogels og utskrift via en ekstrudering-baserte bioprinter for å opprette en 3D-modell som etterligner i vivo -microenvironment. Utviklet 3D-miljøet kan kreftceller til flercellet svulst spheroids (MCTS) med en høy levedyktighet i lange perioder med cellekulturer (> 30 dager). Denne protokollen demonstrerer metodikkene of syntetisere sammensatt hydrogels karakteriserer materialers mikrostruktur og om utskrift er mulig, bioprinting mobilnettet heterogene modeller, og observere dannelsen av MCTS. Disse metodene kan brukes på andre bioinks i extrusion bioprinting også på ulike utførelser av heterogen vev modeller med potensielle programmer i narkotikarelaterte screening, celle migrasjon analyser og studier som fokuserer på grunnleggende celle fysiologiske funksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celle-laden strukturer kan kompromitteres hvis forurensning (biologiske eller kjemiske) oppstår når som helst i prosessen. Vanligvis biologiske forurensning er sett etter to eller tre dager av kultur som en farge endring i kultur media eller bioprinted struktur. Derfor er sterilisering (fysisk og kjemisk desinfeksjon) et viktig skritt for alle celle-relaterte prosesser. Merke, autoklavering gelatin endrer gelling egenskaper, som gjorde det gel tregere i forsøkene vi gjennomførte. Derfor sterilisert vi alginate og gel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tao Jiang Takk Kina stipend råd (201403170354) og McGill Engineering doktorgrad Award (90025) for sine stipend midler. Jose G. Munguia-Lopez Takk CONACYT (250279, 290936 og 291168) og FRQNT (258421) om sine stipend midler. Salvador Flores-Torres Takk CONACYT for sine stipend midler (751540). Joseph M. Kinsella Takk National Science og Engineering Research Council, det kanadiske stiftelsen for innovasjon, Townshend-Lamarre Family Foundation og McGill University for deres finansiering. Vi vil gjerne takke Allen Ehrlicher for tillater oss å bruke sin rheometer, Dan Nicolau for å la oss bruke hans AC confocal mikroskop og Morag Park for å gi oss tilgang til fluorescently merket linjer.
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
Riferimenti
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
- Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
- Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
- Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
- Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
- Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
- Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Ingegneria. 1 (2), 269-274 (2015).
- Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
- Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
- Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
- Coussot, P. . Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , (2005).
- Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020 (2016).
- Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
- Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003 (2016).
- Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
- Bingham, E. C. . Fluidity and plasticity. , (1922).
- Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
- Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).
