JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

Published: July 02, 2018
doi:
10.3791/57826
, , , , , ,
1Department of Mechanical Engineering,McGill University Montreal, 2Department of Bioengineering,McGill University Montreal, 3Department of Molecular Biology,Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C. (IPICyT), 4Department of Mining and Materials Engineering,McGill University Montreal, 5Department of Biomedical Engineering,McGill University Montreal

Summary

Biz bir bioprintable aljinat/jelatin bioink gömülü ölümsüzleştirdi tümör ve fibroblast hücreleri içeren türdeş olmayan meme kanseri modeli geliştirilmiştir. Model vivo içinde tümör microenvironment recapitulates ve çok hücreli tümör pulcuklarının, kavrama tumorigenesis sürüş mekanizmaları içine verimli oluşumunu kolaylaştırır.

Abstract

Yerel tümör microenvironment hücresel, Biyokimya ve biyofizik heterojen geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü kullanarak büyüyen ölümsüzleştirdi kanser hücre hatları ile recapitulated değil. Sayede hücreler farklı türde katıştırılmış türdeş olmayan üç boyutlu (3D) tümör modelleri oluşturmak için bioprinting teknikleri kullanarak bu zorlukların üstesinden gelebilir. Aljinat ve jelatin bioprinting biyouyumluluk, Biyomimikri ve mekanik özellikleri nedeniyle istihdam en yaygın Biyomalzeme ikisidir. İki polimerler birleştirerek, bioprintable bileşik hidrojel yerli tümör stroma mikroskobik mimariye benzerlikler ile elde etti. Biz yolu ile bileşik hidrojel Reolojisi baskıya okudu ve en uygun yazdırma penceresi elde. Meme kanseri hücreleri ve fibroblast hydrogels içinde gömülü ve in vivo microenvironment taklit eden bir 3D model oluşturmak için yazdırılabilir. Bioprinted heterojen modeli uzun vadeli hücre kültürü (> 30 gün) için yüksek bir canlılık sağlar ve destekler çok hücreli tümör pulcuklarının (MCTS) içine meme kanser hücrelerinin kendinden montajlı. Biz göç ve kanser ilişkili fibroblast hücre (restorantlar) etkileşim MCTS bu modelde gözlenen. Bioprinted hücre kültür platformlar ortak kültür sistemleri olarak kullanarak, tumorigenesis bağımlılığını stroma kompozisyon çalışması için benzersiz bir araç sunar. Bu teknik özellikleri yüksek üretilen iş, düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik ve ayrıca geleneksel hücre monolayer kültürleri için alternatif bir model ve kanser biyoloji çalışmaya hayvan tümör modelleri sağlayabilir.

Introduction

2D hücre kültürü yaygın kanser araştırmalarında kullanılan rağmen hücrelere besin ve oksijen Tekdüzen bir konsantrasyon monolayer biçimiyle yetiştirilen gibi sınırlamalar var. Bu kültürler eksikliği önemli hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri yerli tümör microenvironment (TME) mevcut. Sonuç olarak, bu modeller özetlemek kötü sonuçlanan anormal hücre davranışları doğal olmayan türleri morfoloji, düzensiz reseptör organizasyon, membran polarizasyon ve aralarında anormal gen ekspresyonu da dahil olmak üzere, fizyolojik şartlarda koşulları1,2,3,4. Öte yandan, 3D hücre kültürü, nerede hücreleri hacimsel bir alanda toplamları, pulcuklarının veya organoids genişletilir, temel hücre biyolojisi ve Fizyoloji çalışmaya daha doğru vitro ortamlar oluşturmak için alternatif bir teknik sunar. 3D hücre kültür modelleri aynı zamanda yerel TME vitro1,4,5kritik fizyolojik özellikleri hücre-ECM etkileşimleri teşvik edebilir. Ortaya çıkan 3D bioprinting teknoloji heterojen TME taklit modeller oluşturmak için olanak sağlar.

3D bioprinting hızlı prototipleme türetilir ve yaşam karmaşıklığı bazılarına taklit yeteneği olan 3D microstructures imalatı sağlar doku örnekleri6,7. Geçerli bioprinting yöntemleri mürekkep püskürtmeli, ekstrüzyon ve yazdırma8lazer destekli içerir. Bunlar arasında Ekstrüzyon yöntemi heterojenite içinde yazılı matrisler malzemelerin farklı türleri farklı başlangıç yerlerde tam konumlandırma tarafından denetlenmesini sağlar. Bu nedenle, bu hücre veya matrisler birden çok türü içeren türdeş olmayan vitro modelleri imal etmek en iyi yaklaşımdır. Ekstrüzyon bioprinting kulak çevresi şeklindeki iskele9, vasküler yapılar10,11,12, kurmak ve doku13yüksek yazdırma sadakat ve hücre ile sonuçlanan, cilt için başarılı bir şekilde kullanılmıştır canlılığı. Teknoloji de çok yönlü malzeme seçimleri, bir bilinen yoğunluğu ve yüksek tekrarlanabilirlik14,15,16,17 ile gömülü hücrelerle malzemeleri yatırmak için yetenek özellikleri . Doğal ve sentetik hydrogels sık onların biyouyumluluk, bioactivity ve yapısal olarak ECM7,18 benzemeye mühendislik hidrofilik ağlarına nedeniyle 3D bioprinting için bioinks kullanılır ,19,20,21,22,23. Hydrogels, aynı zamanda beri hücreleri, yapı elemanları, geçirgenliği besin ve gazlar için yapıştırıcı siteleri içerebilir ve teşvik etmek için uygun mekanik özellikleri geliştirme24hücre avantajlı vardır. Örneğin, kollajen hydrogels integrin hücreleri matrisin için eklemek için kullanabilirsiniz anchorage siteleri sunar. Jelatin, denatüre kollajen, benzer hücre adezyon siteleri korur. Buna ek olarak, aljinat bioinert ancak Glossar divalent iyonları25,26,27,28ile oluşturarak mekanik bütünlük sağlar.

Bu çalışmada, aljinat ve jelatin, bir yerel tümör stroma mikroskobik mimarisini benzerlikler ile oluşan bir bioink olarak bileşik hidrojel geliştirdik. Meme kanseri hücreleri ve fibroblast hydrogels içinde gömülü ve üzerinden bir ekstrüzyon tabanlı bioprinter in vivo microenvironment taklit eden bir 3D model oluşturmak için yazdırılabilir. Mühendislik 3D çevre çok hücreli tümör pulcuklarının (MCTS) oluşturmak kanser hücrelerinin hücre kültürü (> 30 gün) uzun süre ile yüksek bir canlılık verir. Bu iletişim kuralı bileşik hydrogels sentezleme, malzemelerin mikroyapı ve baskıya, bioprinting hücresel türdeş olmayan modelleri, karakterize ve MCTS oluşumu gözlemleyerek yöntemleri gösterir. Bu metodolojileri ekstrüzyon bioprinting de türdeş olmayan doku modelleri farklı tasarımlar olarak içinde diğer bioinks uyuşturucu tarama, hücre göç deneyleri ve temel cep telefonundan odak çalışmaları potansiyel uygulamalar ile uygulanabilir fizyolojik fonksiyonları.

Protocol

1. malzeme, hidrojel ve hücre kültür malzemelerin hazırlanması Malzeme ve eriyik hazırlığı Yıkayıp kurulayın 250 mL ve 100 mL Cam şişeler, manyetik karıştırıcı, spatula, 10 mL kartuş, 25 G silindirik püskürtme (0.5 uzunluğunda) ve 250 µm bir iç çapı ile. Malzemeler tarafından ısıyla sterilize 121 ° C/15 dk onları/1 atm. tutmak malzemeler steril koşullarda kadar kullanmak.Not: satıcı bilgileri Tablo reçetesi bakın. A…

Representative Results

Sıcaklık süpürme A3G7 habercisi 25 ° C ve 37 ° c de ayrı bir fark gösterir Habercisi 37 ° C’de sıvı ve 1938.1 ± 84.0 mPa karmaşık bir viskozite vardır bir büyük G tarafından doğrulanır s x “G üzerinde ‘. Sıcaklık azaldıkça habercisi jelatin molekülleri spontan fiziksel Dolaşıklık tri-helix oluşumu29,30içine nedeniyle fiziksel jelleşme uğrar. Her iki G’ ve G “artırmak ve sol-jel geçiş gösteren 3…

Discussion

Kirlenme (biyolojik ya da kimyasal) sürecinde herhangi bir noktada oluşursa hücre yüklü yapıları tehlikeye girebilir. Genellikle, biyolojik kirlenme iki sonra görülür veya kültür medya veya bioprinted yapı ile üç gün kültür bir renk olarak değiştirin. Bu nedenle, sterilizasyon (fiziksel ve kimyasal dezenfeksiyon) tüm hücre ile ilgili işlemler için önemli bir adımdır. Önemli, ısıyla jelatin daha yavaş jel biz yürütülen çalışmalarda yapılan jelleşme özelliklerini değiştirir. Bu ned…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tao Jiang Çin burs Konseyi (201403170354) ve McGill Mühendisliği doktora Ödülü (90025) kendi burs finansman için teşekkürler. Jose G. Munguia-Lopez CONACYT (250279, 290936 ve 291168) ve FRQNT (258421) kendi burs finansman için teşekkürler. Salvador Flores-Torres CONACYT (751540) finansman onların burs için teşekkürler. Joseph M. Kinsella Ulusal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada Vakfı yenilik, Townshend-Lamarre Aile Vakfı ve McGill Üniversitesi için kendi finansman için teşekkürler. Allen Ehrlicher onun rheometer Dan bize fluorescently etiketli hücre hatları için erişim vermek için onun confocal mikroskop ve Morag Park kullanmak bize izin verdiği Nicolau kullanmak için bize izin verdiği için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O’Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Ingegneria. 1 (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. . Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. . Fluidity and plasticity. , (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).

Tags

Keywords: 3D In Vitro ModelBioprintable HydrogelAlginateGelatinCell Spheroid FormationCancer BiologyTumor FormationCell MigrationCell SignalingRheologyCell CompatibilityBiosafetyCentrifugationRheometer
check_url/it/57826?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image