Abbiamo sviluppato un modello di cancro al seno eterogeneo costituito da cellule del tumore e del fibroblasto immortalate incorporate in un bioink di alginato/gelatina bioprintable. Il modello ricapitola il microambiente tumorale in vivo e facilita la formazione di sferoidi multicellulari tumore, producendo la comprensione dei meccanismi di tumorigenesi di guida.
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Articolo metodologico
Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'eterogeneità di cellulare, biochimico e biofisico del microambiente tumorale nativo non è ricapitolata dalla crescente linee cellulari di cancro immortalizzate mediante coltura convenzionale cellulare bidimensionale (2D). Queste sfide possono essere superate utilizzando tecniche multimateriali per costruire modelli eterogenei tridimensionale (3D) del tumore per cui sono incorporati diversi tipi di cellule. Alginato e gelatina sono due dei più comuni biomateriali impiegati in multimateriali dovuto la loro biocompatibilità, biomimicry e proprietà meccaniche. Combinando i due polimeri, abbiamo raggiunto un idrogel composito bioprintable con analogie con l'architettura microscopica di stroma del tumore nativo. Abbiamo studiato la stampabilità di idrogel composito tramite reologia ed abbiamo ottenuto la finestra di stampa ottima. Fibroblasti e cellule di cancro al seno sono stati incorporati nel caso degli idrogeli e stampati per formare un modello 3D che imita il microambiente in vivo . Il modello eterogeneo di bioprinted raggiunge un'alta redditività per colture cellulari a lungo termine (> 30 giorni) e promuove l'auto-assemblaggio delle cellule di cancro al seno in sferoidi multicellulari tumore (MCTS). Abbiamo osservato la migrazione e l'interazione delle cellule del cancro-collegata del fibroblasto (CAFs) con il MCTS in questo modello. Utilizzando piattaforme di cultura cellulare bioprinted come sistemi di co-coltura, offre uno strumento unico per studiare la dipendenza della tumorigenesi sulla composizione dello stroma. Questa tecnica presenta un alto-rendimento, basso costo e alta riproducibilità, e può anche fornire un modello alternativo per colture monostrato cellulare convenzionale e modelli animali del tumore per lo studio di biologia del cancro.
Introduzione
Anche se la coltura delle cellule 2D è ampiamente usato nella ricerca sul cancro, esistono limitazioni come le cellule sono coltivate in un formato monostrato con una concentrazione uniforme di nutrienti e ossigeno. Queste culture mancano importante cellula-cellula e delle interazioni cellula-matrice presentano nel microambiente tumorale nativo (TME). Di conseguenza, questi modelli ricapitolano mal condizioni fisiologiche, conseguente a comportamenti aberrante delle cellule, tra cui morfologie innaturale, recettore irregolare organizzazione, polarizzazione di membrana ed espressione genica anormale, tra l'altro condizioni1,
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Protocollo
1. preparazione dei materiali, idrogel e Cell Culture materiali
-
Preparazione materiale e soluzione
- Lavate e asciugate 250 mL e Coppe di vetro 100ml, agitatori magnetici, spatole, cartucce da 10 mL, 25 G ugelli cilindrici con (una lunghezza di 0,5 in) e un diametro interno di 250 µm. Sterilizzare in autoclave i materiali li a 121 ° C/15 min/1 ATM conservare il materiale in condizioni sterili fino all'utilizzo.
Nota: Fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni sul fornitore. - Pesare 3G di alginato (3% p/v) e 7 g di gelatina (7% w/v) (indicato come A3G7 qui di seguito).
- Sterilizza....
- Lavate e asciugate 250 mL e Coppe di vetro 100ml, agitatori magnetici, spatole, cartucce da 10 mL, 25 G ugelli cilindrici con (una lunghezza di 0,5 in) e un diametro interno di 250 µm. Sterilizzare in autoclave i materiali li a 121 ° C/15 min/1 ATM conservare il materiale in condizioni sterili fino all'utilizzo.
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Risultati
Lo sweep di temperatura Mostra una netta differenza del precursore A3G7 a 25 ° C e 37 ° C. Il precursore è liquido a 37 ° C ed ha una viscosità complessa di 1938.1 ± 84,0 mPa x s, che viene convalidato da un G maggiore "sopra G'. Come la temperatura diminuisce, il precursore subisce gelificazione fisica dall'impigliamento fisica spontanea delle molecole gelatina in un tri-elica formazione29,30. Entrambi i G' e G "aumentare e conve.......
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Discussione
Cella-carichi strutture possono essere compromessa in caso di contaminazione (biologico o chimico) in qualsiasi punto nel processo. Di solito, contaminazione biologica è visto dopo due o tre giorni di cultura come un colore cambiare in terreni di coltura o la struttura di bioprinted. Di conseguenza, la sterilizzazione (disinfezione chimica e fisica) è un passo fondamentale per tutti i processi di cella. Degno di nota, gelatina di sterilizzazione in autoclave cambia le proprietà gelificanti, che ha reso più lento del gel .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Tao Jiang grazie la Cina Scholarship Council (201403170354) e McGill Engineering Award dottorato (90025) per il loro finanziamento di borse di studio. Jose G. Munguia-Lopez grazie CONACYT (250279, 290936 e 291168) e FRQNT (258421) per il loro finanziamento di borse di studio. Salvador Flores-Torres grazie CONACYT per loro borsa di studio (751540) di finanziamento. Joseph M. Kinsella grazie della National Science ed Engineering Research Council, la Fondazione canadese per l'innovazione, Townshend-Lamarre Family Foundation e McGill University per il loro finanziamento. Vorremmo ringraziare Allen Ehrlicher per averci permesso di utilizzare il suo reometro, Dan Nicolau pe....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alginato di sodio | FMC Biopolimero | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G9391 | Gelatina di tipo B da pelle bovina |
| salina tamponata con fosfato di Dubelcco (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, senza calcio, senza magnesio |
| Piastra riscaldante magnetica | Corning | N/A | Agitatore/piastra riscaldante modello PC-420 |
| Provette da centrifuga da 50 mL | Corning | 352098 Falcon® 50mL Provetta da centrifuga in PP ad alta chiarezza, fondo conico, | |
| centrifuga | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Cloruro di calcio anidro | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ acqua | Millipore | N/A | |
| Millipore 0,22 µ m filters | Millipore | SLGS033SB | filtro siringa Millex-GS, 0,22 µ m, esteri misti di cellulosa, 33 mm, sterilizzato con ossido di etilene |
| Reometro oscillante MCR 302 | Anton Paar | N/A Strumento | |
| di misura reometrico CP25 | Anton Paar | 79038 | Geometria della piastra conica per reometro |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A Software | di controllo del reometro MCR 302 |
| Microscopio elettronico a scansione | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Pressione variabile |
| Paraformaldeide, 96%, purissimo | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Soluzione antibiotica/antimicotica (100X) stabilizzata | Sigma | A5955 | |
| Siero fetale bovino | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Fiasche per colture cellulari T-75 | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 Trattamento superficiale TC-Trattato |
| Bioprinter 3D BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| Software GeSim | GeSiM | N/A | Software di controllo BioScaffolder 3.1 |
| cartuccia da 10 cc resistente ai raggi UV | EFD Nordson | 7012126 | |
| Tappo terminale | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tappo punta | EFD Nordson | ||
| Pistone | EFD Nordson | 7012182 | |
| Ugello in acciaio inox G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Bagno d'acqua | VWR | N/A | |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagente, per biologia molecolare |
| Costar Piastre a 6 pozzetti | trattate con TC Corning | 3516 | , confezionate singolarmente, sterili |
| Microscopio invertito a disco rotante confocale | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous Saggio di proliferazione cellulare in una soluzione |
| Kit di citotossicità di vitalità viva/morta | Sonde molecolari, ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Tripsina 0,25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Piastra Corning a 96 pozzetti | Corning | 3595 | Micropiastra in polistirene trasparente a fondo piatto trattato con TC, confezionata singolarmente, con coperchio a bassa evaporazione, |
| autoclave sterile Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizzatore Modello Elettronico con 4 Vassoi in Acciaio Inox, Capacità 23L |
| Trypan blu | Invitrogen | T10282 | Soluzione allo 0,4% |
| Etanolo | Alcoli commerciali | P016EA95 | Alcoli speciali Greenfield |
| 2 Incubatore | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Liofilizzatore | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | Software CAD utilizzato per costruire un modello dimostrativo simile a un'elica |
| MATLAB | Il software di programmazione MathWorks | N/A | utilizzato per generare il codice G per BioScaffolder 3.1 |
Riferimenti
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
- Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroi....
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Ristampe e permessi
