Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen
Summary
De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl– -kanalen.
Abstract
Het menselijk genoom codeert vier bestrophin paralogs, namelijk BEST1, BEST2, BEST3 en BEST4. BEST1, gecodeerd door de BEST1 gen, is een Ca2 +-Cl– kanaal (CaCC), voornamelijk uitgedrukt in retinale pigment epitheel (RPE) geactiveerd. De fysiologische en pathologische betekenis van BEST1 wordt benadrukt door het feit dat meer dan 200 verschillende mutaties in het gen BEST1 genetisch zijn gekoppeld aan een spectrum van ten minste vijf retinale degeneratieve aandoeningen, zoals de beste vitelliform macula dystrofie (ziekte van de beste). Daarom heeft begrijpen de biofysica van bestrophin kanalen op het niveau van de single-molecuul enorme betekenis. Verkrijgen van gezuiverde zoogdieren ionenkanalen is echter vaak een uitdagende taak. Wij rapporteren hier, een protocol voor de expressie van zoogdieren afkomstig bestrophin eiwitten met het transfersysteem voor BacMam baculovirus gen en hun zuivering door affiniteit en grootte-uitsluiting-chromatografie. De gezuiverde eiwitten hebben het potentieel om te worden gebruikt in latere functionele en structurele analyses, zoals elektrofysiologische opname in lipide bilayers en kristallografie. Nog belangrijker is, kan deze pijpleiding worden aangepast aan het bestuderen van de functies en structuren van andere ionenkanalen.
Introduction
Bestrophins zijn een familie van ionenkanalen geconserveerd door middel van soorten, variërend van bacterie tot mens1. Bij de mens codeert het BEST1 gen gelegen op chromosoom 11q12.3, het membraan eiwit Bestrophin-1 (BEST1) die zich voornamelijk in het basolaterale membraan van retinale pigment epitheel (RPE) cellen van de ogen2,3 ,4. Bestaat uit 585 aminozuren, de eerste ~ 350 waarvan sterk tussen de soorten zijn geconserveerd en bevatten de transmembrane regio, fungeert BEST1 als een CaCC in mensen1,5,6. Bovendien, de BEST1 homologen in kippen en Klebsiella pneumoniae beide fungeren als homopentamers7,8, hetgeen wijst op een hoog niveau van bescherming in de gehele evolutie.
Bij de mens, zijn meer dan 200 mutaties in het gen BEST1 klinisch gekoppeld aan een groep van ziekten van de retina degeneratie genoemd bestrophinopathies1,9. Vijf specifieke bestrophinopathies zijn gemeld, met inbegrip van beste ziekte, volwassen-onset vitelliform dystrofie, autosomaal dominante vitreoretinochoroidopathy, autosomaal recessieve bestrophinopathy en retinitis pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Deze ziekten, die tot verminderde gezichtsvermogen en zelfs blindheid leiden, zijn momenteel onbehandelbaar. Oog op de ontwikkeling van therapeutische behandelingen en potentieel gepersonaliseerde geneeskunde, is het essentieel om te begrijpen hoe deze BEST1 ziekte-veroorzakende mutaties invloed op de functie en structuur van de BEST1 kanaal15. Voor deze doeleinden moeten onderzoekers voeren in vitro analyses5,8te verkrijgen van gezuiverde bestrophin (wild type en/of mutant) kanalen.
De eerste belangrijke stap is de uitdrukking van bestrophin kanalen van hogere diersoorten in zoogdiercellen. Zoals baculovirus signaaltransductie van cellen van de HEK293-F (het BacMam-systeem) een krachtige methode is om geïnfecteerd express membraan eiwitten16,17, dit protocol maakt gebruik van een geoptimaliseerde BacMam vector (pEG BacMam) voor robuuste uitdrukking van de doel eiwit18, dat in dit geval een homolog van de zoogdieren bestrophin. Deze vector is gebruikt voor de uitdrukking van verschillende membraaneiwitten, met inbegrip van de G-proteïne-gekoppelde receptoren, nucleaire receptoren en andere ion kanalen18. Er is ook bewijs dat de geproduceerde eiwitten geschikt voor kristallografie18 zijn. Met hoge niveaus van meningsuiting in HEK293-F cellen, kunnen de eiwitten dan worden gezuiverd met behulp van chromatografie; in het bijzonder in het geval van bestrophins, zowel affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie kunnen worden gebruikt.
Zodra dit protocol afgestemd voor een bestrophin-kanaal is, kan de gezuiverde proteïne vervolgens worden geanalyseerd voor de functie en structuur door middel van vlakke lipide dubbelgelaagde en röntgendiffractie, respectievelijk5,8. Over het geheel genomen is deze technieken bieden een krachtige pijpleiding voor functionele en structurele onderzoek van bestrophins en andere ionenkanalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een handig pijpleiding voor expressie en zuivering van zoogdieren bestrophin ionenkanalen om te worden gebruikt voor toekomstige in vitro analyses. Terwijl het FPLC apparaat vereist voor de chromatografie van de grootte-uitsluiting is, is een spuitpomp voldoende voor alle stappen van de chromatografie van de affiniteit met inbegrip van bindende, wassen en eluerende. Wanneer u een spuitpomp naar oplossingen van de Duw (op een spuit) door een kolom, is het essentieel voor de onderlaag van d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door de NIH grants EY025290, GM127652 en Universiteit van Rochester start-up financiering.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
