Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin
Summary
La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl– .
Abstract
El genoma codifica cuatro paralogs de bestrophin, es decir, BEST1, BEST2, BEST3 y BEST4. BEST1, codificada por el gen BEST1 , es un Ca2 +-activa Cl– canal (CaCC) predominante expresado en epitelio retiniano del pigmento (RPE). La importancia fisiológica y patológica de BEST1 destaca por el hecho de que más de 200 mutaciones distintas en el gen BEST1 se han relacionado genéticamente con un espectro de por lo menos cinco trastornos degenerativos retinianos, como vitelliform mejor distrofia macular (enfermedad de Best). Por lo tanto, comprensión de la biofísica de canales de bestrophin a nivel de una sola molécula tiene gran importancia. Sin embargo, obtención de canales iónicos mamíferos purificada es a menudo una tarea difícil. Aquí, Divulgamos un protocolo para la expresión de proteínas de mamíferos bestrophin con el sistema de transferencia de genes de BacMam baculovirus y su purificación por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. Las proteínas purificadas tienen el potencial para ser utilizados en posteriores análisis funcionales y estructurales, como la grabación electrofisiológica en bicapas lipídicas soportadas y Cristalografía. Lo importante, esta tubería puede ser adaptada para el estudio de las funciones y estructuras de otros canales iónicos.
Introduction
Bestrophins son una familia de canales iónicos, conservada a través de especies diferentes de bacterias a los seres humanos1. En los seres humanos, el gene BEST1 , situado en el cromosoma 11q12.3, codifica la proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expresa predominantemente en la membrana basolateral de las células del epitelio (RPE) pigmentario de la retina de los ojos2,3 ,4. Compuesta por 585 aminoácidos, el primer ~ 350 de los cuales están muy conservadas entre especies y contienen su región transmembrana, BEST1 actúa como un CaCC en los seres humanos1,5,6. Además, los homólogos BEST1 en pollos y Klebsiella pneumoniae funcionan como homopentamers7,8, lo que sugiere un alto nivel de conservación a lo largo de la evolución.
En los seres humanos, más de 200 mutaciones en el gen BEST1 han sido clínicamente asociadas a un grupo de enfermedades de degeneración retiniana llamado bestrophinopathies1,9. Cinco bestrophinopathies específicas se han divulgado, incluyendo enfermedad mejor, vitelliform adulto distrofia, autosómica dominante vitreoretinochoroidopathy, bestrophinopathy recesivo autosomal y pigmentosa de la retinitis3,4 ,10,11,12,13,14. Estas enfermedades, que conducen a la disminución de la visión e incluso ceguera, son actualmente intratables. Con el fin de desarrollar tratamientos terapéuticos y medicina personalizada potencialmente, es fundamental para entender cómo estas mutaciones enfermedad-que causan BEST1 influyen en la función y la estructura del BEST1 canal15. A estos efectos, los investigadores deben obtener canales de bestrophin purificada (tipo salvaje y mutante) y llevar a cabo in vitro análisis5,8.
El primer paso clave es la expresión de canales de bestrophin de especies mayores en células de mamíferos. Como baculovirus transduction de las células HEK293-F (el sistema de BacMam) es un método poderoso para expresar heterologously membrana proteínas16,17, este protocolo utiliza un vector de BacMam optimizado (pEG BacMam) para la expresión robusta de la objetivo proteína18, que en este caso es un homólogo de mamífero bestrophin. Este vector se ha utilizado para la expresión de diversas proteínas de membrana, incluyendo receptores g-proteína-juntados, receptores nucleares y otros canales de iones18. También hay evidencia de que las proteínas producidas son convenientes para Cristalografía18. Con altos niveles de expresión en células HEK293-F, las proteínas se pueden entonces purificar mediante cromatografía; específicamente, en el caso de bestrophins, afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño pueden utilizarse.
Una vez que este protocolo está optimizado para un canal de bestrophin, la proteína purificada puede entonces analizarse por su función y estructura a través de la bicapa lipídica planar y Cristalografía de rayos x, respectivamente de5,8. En conjunto, estas técnicas proporcionan una tubería de gran alcance para las investigaciones funcionales y estructurales de bestrophins y otros canales de iones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un oleoducto útil para la expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos bestrophin a utilizarse para el análisis futuro de vitro . Mientras que el dispositivo FPLC es necesario para la cromatografía por exclusión de tamaño, una bomba de jeringa es suficiente para todos los pasos de cromatografía de afinidad como vinculante, lavado y liberador. Cuando se utiliza una bomba de jeringa para soluciones de push (en jeringa) a través de una columna, es esencial para el …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH EY025290 y GM127652 de la Universidad de Rochester financiación de puesta en marcha.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
Riferimenti
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