低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験
Summary
ここで低酸素の条件の下で内因性の核蛋白質間蛋白質蛋白質の相互作用を研究する co 免疫沈降プロトコルについて述べる。このメソッドは、転写因子と低酸素で転写共役因子との相互作用のデモンストレーションに適しています。
Abstract
低酸素レベル (低酸素) は、さまざまな低酸素誘導因子 1 (HIF 1) マスターの調整装置として複雑な適応応答をトリガーします。HIF 1 ヘテロ二量体酸素によって調節される α サブユニット (HIF-1 α) から成り、血管新生を含む多様なプロセスに関与する遺伝子を調節する β サブユニット (HIF 1 β) として知られている芳香族炭化水素受容体核移行因子 (ARNT) されて、赤芽球および解糖系。HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達経路を理解する鍵です。HIF-1 α の安定性の規則、ほか低酸素症はまた HIF-1 α ARNT など多くの転写因子の核内移行をトリガーします。特に、このようなタンパク質-タンパク質相互作用 (Ppi) を研究するために使用する現在の方法のほとんどは、タンパク質レベルは人為的に蛋白過剰発現を増加させるシステムに基づいています。多くの蛋白の過剰発現は、時空の成果物から生じる非生理的結果に します。ここで変更された co-免疫沈降を記述プロトコルの内因性の核蛋白質を使用して低酸素血症の治療の後、HIF-1 α と ARNT の相互作用を表示する概念の証拠として。このプロトコルでは低酸素細胞が低酸素の条件の下で収穫された、ダルベッコの (DPBS) Phosphate-Buffered 生理食塩水洗浄バッファーも感受タンパク質分解やタンパク質複合体を軽減するために使用する前にあらかじめ釣合い再酸素化中に解離します。さらに、核の一部分を集中、内因性の核蛋白質の安定化と蛋白過剰発現時にしばしば見られる誤った結果を避けるために抽出した後。このプロトコルは、転写因子と低酸素の条件の下で転写共役因子と内因性とネイティブ相互作用を実証する使用できます。
Introduction
低酸素は、細胞や体の組織に十分な酸素が供給されてときに発生します。幹細胞の分化、炎症やがん1,2など様々 な生理学的および病理学的プロセスの重要な役割を果たします。低酸素症誘引可能な要因 (HIFs) は、酸素によって調節される α サブユニットと恒常発現 β サブユニットとして知られている ARNT3から成るヘテロとして機能します。HIF α サブユニット (HIF-1 α、HIF 2α、HIF 3 α) と 3 つの HIF β サブユニット (ARNT/HIF-1 β、ARNT2、ARNT3) の 3 つのアイソ フォームは、日付に確認されています。HIF 2α、HIF 3 α、ARNT2 および ARNT3 はより表現パターン4を制限されているに対し、HIF-1 α と ARNT は表現普遍的。HIF 1 タンパク質複合体は、低酸素応答のキーのレギュレータです。低酸素の条件の下で HIF-1 α 化が安定、核に移行し、ARNT5とされています。その後、この複合体は低酸素応答要素 (HREs) として知られている特定のヌクレオチドに結合し、血管新生、赤血球、解糖系の6を含む多様なプロセスに関与する標的遺伝子の発現を調節します。この「標準」の応答に加えて低酸素シグナル伝達経路も知られているクロストークにシグナル伝達経路のノッチと核因子 κ B (NF-κ B) など複数の細胞応答と7,8,9。
小説 HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達経路の理解にとって重要です。ARNT は、酸素濃度に鈍感と恒常発現と対照をなして HIF-1 α タンパク質レベルは細胞の酸素濃度によって堅く調整されます。常 (21% 酸素)、HIF-1 α タンパク質は急速に劣化した10,11。常に HIF-1 α の短い半減期は、HIF 1 α 相互作用するタンパク質の同定のためだけでなく、細胞抽出液からの蛋白質を検出するための特定の技術的な課題を提示します。さらに、HIF 1 複合体のそれらを含むいくつかの転写因子は、低酸素条件12,13,14下核に若し。PPI の研究のための現在の方法のほとんどは、非生理的な発現タンパク質を使用して実行されます。このような蛋白の過剰発現は、リソースの過負荷、化学量論的不均衡、無差別相互作用および経路変調15,16を含む複数のメカニズムを通して異なる携帯電話の不具合が発生する報告されています。PPI の研究面で蛋白過剰発現は偽肯定的、またはも偽陰性、タンパク質の特性と発現タンパク質の機能によって結果につながることができます。したがって、PPI の研究の現在の方法は、低酸素条件下での生理関連 PPIs を明らかにするために変更する必要。我々 は以前、HIF 1 と Ets ファミリー転写因子Hes1プロモーターの低酸素17レスポンスに貢献する低酸素の P19 細胞における GA 結合タンパク質 (GABP) との間の相互作用を実証しました。ここでは、低酸素条件下で内因性の核蛋白質間 PPIs を勉強する co 免疫沈降プロトコルについて述べる。HIF-1 α と ARNT の相互作用は、コンセプトの証明として表示されます。このプロトコルは転写因子と低酸素の条件の下で転写共役因子間の相互作用を示す適して、HIF 1 相互作用するタンパク質の同定に限定されません。
Protocol
Representative Results
Discussion
HIF 1 複合体細胞酸素恒常性のマスター調節因子は、低酸素に異なる細胞適応応答に関与する遺伝子の茄多を調節する.新規 HIF 1 相互作用するタンパク質の同定は、低酸素シグナル伝達機構を理解するために重要です。一般的に Co 免疫沈降実験 PPIs 研究細胞シグナル伝達経路の線引きされます。しかし、蛋白過剰発現はまだ広く使用されて、これは実験の成果物につながる可能性があります。?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は低酸素ワークステーション用准教授罪ティオン ・ オングを感謝します。この作品は、次によって支えられた: シンガポールの教育省、南洋工科大学創業助成金 M4230003 (P.O.B.) に内科のビジネススクール、MOE2015-T2-2-087 (ワイ ・ エイ) に萌え 1T1-02/04 スウェーデン研究評議会、家族 – スウェーデンペーションアー財団、ノボ ノルディスク財団、スティヒティング af Jochnick 財団、スウェーデン糖尿病協会、スカンジア保険会社、糖尿病の研究、健康財団、バース ・ フォン ・ Kantzow、カロリンスカ研究所、アリス バレンベリー財団し ERC ERC 2013 AdG 338936-Betalmage、クヌートの糖尿病戦略研究プログラムです。
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
Riferimenti
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