원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정
Summary
여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.
Abstract
이 메서드는 원형질 막 어떤 붙일 태그가 주변 관련 단백질의 원형질 막에 걸쳐 형광 강도의 프로필을 사용 하 여 분할의 결정에 대 한 빠른 접근을 제공 합니다. 측정 된 형광 프로필 셀 주변에 수직으로 적용 하는 선 따라 막과 세포질 형광 분배 모델에 적합 하다. 이 모델은 FM 4 64 표시 된 원형질 막과 세포질 붙일 태그 마커를 표현 하는 참조 셀의 형광 강도 값에서 생성 됩니다. 다양 한 세포 유형 및 유기 체; 메서드를 적용할 수 있습니다. 그러나, 비 이웃 세포의 플라즈마 막만 평가할 수 있습니다. 이 빠른 현미경-기반 방법은 실험, 플라즈마 멤브레인 관련 마커의 미묘 하 고 동적 변화가 예상 된다 고 양이 정해질 필요가, 예를 들어, 억제제 치료 단백질의 돌연변이 체 버전의 분석에 적합 그리고 신호 변환 관측. 메서드는 사용자 친화적인 인터페이스 역할 ImageJ 매크로와 결합 된 멀티 플랫폼 R 패키지에 구현 됩니다.
Introduction
주변 관련 된 플라즈마 막 단백질은 세포 신호 통로의 주요 구성 요소. 그들의 과도 플라즈마 멤브레인 협회와 분리, 플라즈마 막과 세포질 사이 신호 변환에 대 한 중요 한 그들의 기본적인 역할 중 하나입니다. 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 지질 앵커 (N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation) 또는 지질 바인딩 도메인 (phosphatidylinositol 인산 염, phosphatidic 산, 와 상호 작용 하 여 원형질 막에 붙어 있을 수 있다 등).
이 단백질의 속성 수 플라즈마 멤브레인 바인딩 검사 vivo에서, 예를 들어, 붙일 태그가 단백질 핵심 아미노산의 사이트 감독 mutagenesis에 의해 수정 될 때 또는 때 그것에 영향을 미치는 다양 한 억제제 처리 됩니다. 지질 신호입니다. 주변 플라즈마 막 단백질의 분포는 주로 되 고 질적으로, 경우에 특히 때 평가 단백질 다시 메일은 분명 합니다. 제시 방법은 상황에 대 한 최적의 단백질 다시 배포만 부분 이며 양적 평가 필요한 때입니다. 플라즈마 멤브레인 협회 confocal에서 추정 되는 때 자주 사용된 접근 레이저 스캐닝 현미경 이미지의 원형질 막에 및 세포질1,2, 형광 강렬 비율 아니다 간단 하지만 정확한. 원형질 막에 형광 강렬 특정 형광 현미경 검사 법 기술과 사용 하는 광학 요소3에 대 한 빛의 회절 특성 때문 원형질 막 및 세포질 신호의 중첩을 반영합니다. 따라서, 세포질 신호 막 지역에도 포함 됩니다. 이러한 이유로, FM 4-64 얼룩 패턴 막 신호 선택4마스크로 사용할 수 없습니다. 또한, 막 신호 FM 4-64 항상 체계적으로 최대 얼룩에 의해 정의 된 위치에서의 간단한 측정 평가의 중첩으로 인해 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질의 진짜 플라즈마 막 신호는 막 그리고 세포질 화합물입니다. 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 관찰 된 신호의 최대 또한 공동 플라즈마 멤브레인 마커 (즉, FM 4-64 styryl 염료), 최대를 지역화 하지 않습니다 하지만 세포질 쪽으로 이동 된다. 또 다른 한계는 FM 4-64 방출 피크는 빛 회절3의 파장 의존성 때문 GFP 같은 녹색 형광 성 단백질을 위한 방출 봉우리에 비해 넓은 사실에 기반입니다.
여기에 설명 된 메서드에서 태그 단백질 신호 원형질 막 세포질 신호를 가상 배포를 설명 하는 것은 각각의 경험적 함수 두 개 장착 되어 있습니다. 이 신호 분해 수직 붙일 태그가 단백질 표현 confocal 섹션 일반, 2 채널 소스 이미지에서 원형질 막으로 세포 표면에 적용 되는 선형 형광 프로필에 적용 됩니다. 셀 FM 4-64 염료와 함께 표시입니다.
피팅을 사용 하는 첫 번째 함수는 셀 가장자리에 세포질 신호의 회절을 설명 합니다. 그것은 관심의 원형질 막 주변 관련 된 단백질으로 같은 발 색 단에 의해 표를 붙인 세포질 단백질 마커를 표현 하는 셀에 측정 되었다 이전 취득된 형광 프로필에서 얻은 것입니다. 원형질 막 신호의 회절을 설명 하는 두 번째 함수는 FM 4-64의 형광에서 파생 됩니다. 이 신호는 점 광원의 빛 회절의 대략적인 모델링에 사용 되는 가우스 함수에 의해 첫째로 직선 근사 줄. 둘째,이 모델, 빨간 FM 4-64 방출에 유효 수학적으로 원형질 막에 대 한 관심의 주변 관련 단백질의 태그에 사용 되는 발 색 단의 방출 파장에 대 한 관련 된 형식으로 변환 됩니다. 두 함수 모두 최대 강도 및 FM 4-64 신호 및 세포질 단백질 신호에 대 한 가장 높은 값의 10%에서 평균 각각 정규화 됩니다. 이 신호 분해 (비-선형 최소 평방 피팅 방법), 원형질 막의 비율과 시험된 단백질의 세포질 분수 수 수 추정 쉽고 정확 하 게. 분할 계수 계산된의 실제 물리적 차원은 세포질 볼륨 농도 표면 농도 플라즈마 멤브레인에 비해 마이크로미터의 범위입니다. 같은 양의 단백질은 원형질 막의 인접 한 지역에서 지역화 된 세포질에 플라즈마 막에서 거리를 정의 합니다. 이 값은 분할 계수 K2 도입 이전5. 방법은 매우 빠르고, 일상적인 confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 인수만 단일 confocal 단면도 요구 하 고 그것은 계산 요구 하지. 분석 핵심 휴대용 R 패키지에 구현 된 고 추가 ImageJ 매크로에서 직관적인 대화 상자는 분석을 실행 하려면 그래픽 사용자 인터페이스를 제공 하기 위해 작성 되었습니다. 소프트웨어 및 방법의 자세한 설명 (이전 출판6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/에서 찾을 수 있습니다.
방법은 절연된 셀, protoplasts, 및 조직에 대 한 적합 한 개별 세포의 원형질 막 명확 하 게 구별할 수 어디에, 주변에 관련 된 단백질 검사의 붙일 태그 구문 표현. 발 색 단 호환 FM 4-64 얼룩을 사용 해야 합니다. FM 4-64에서 빨간 형광; 따라서, 검사 단백질 파란색, 녹색, 또는 황색 방출 (예를 들어, GFP, CFP, YFP)와 형광 단백질에 의해 태그가 될 수 있습니다. 생물학 물자의 안정적인 변화 단백질 분포의 덜 인공 하 고 쉽게 재현 가능한 관측을 수 있기 때문에 것이 좋습니다. 그것은 시험된 단백질 상대적으로 균질 세포질 배포 필요입니다. 바인딩과 그물 또는 다른 세포내 막 구획에 있는 단백질의 지 방화는 인공 결과 생성할 수 있습니다.
또한, 동일한 생물학 물자 세포질 마커를 표현 비교에 사용 해야 합니다. 셀 폐지 막 바인딩 용량 무료 chomophore (같은 사용 되는 태그, 예를 들어, 무료 GFP 주변 단백질)에 의해 또는 관심사의 태그 단백질에 의해 변환할 수 있습니다. 막 바인딩 용량 수 수 폐지, 예를 들어 막 바인딩 도메인의 트리밍 또는 주요 아미노산 잔류물 (예를 들어, 사이트에 대 한 N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation, 등)의 사이트 감독 mutagenesis.
공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대 한 세포 FM 4-64 염료 처럼 막 마커로 표시 해야 합니다. FM (때문에 간섭 autofluorescence, 불 쌍 한 염료 침투 등) 공부 자료에 적합 하지 않으면 4-64 얼룩, 원형질 막 수 표시, 예를 들어 적절 한 chomophore (태그 통합 플라즈마 막 단백질에 의해 mCherry, RFP, 등). 마커 세포내 막 구획 (endomembranes)에서 무시할 현지화가 필수적 이다.
고정된 샘플 및 항 체를 사용 하는 경우 고칠 수 아날로그 FM 4-64FX 또는 플라즈마 멤브레인 라벨 적절 한 대상에 대 한 항 체에 의해 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 고정 절차 단백질의 선택적 손실 세포질과 원형질 막에서 이어질 수 있기 때문에 매우 신중 하 게 결과 평가에 필수적 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 설명 하는 방법을 원형질 막 형광 강도5측정에 따라 다른 방법에 비해 주변 관련된 단백질에 대 한 분할의 더 정확한 견적을 생성 합니다. 이 방법의 주요 향상은 그것 계정에 빛의 회절 및 원형질 막의 세포질 신호 중첩입니다. 비록 이러한 메서드 결과 평균 세포질 막 위치에서 형광 강도의 비교에 기반 하는 간단한 방법의 결과와 상관 관계에는 신호 (같이 이전<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 NPU에 의해 지원 되었다 I, LO1417 (교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국).
Materials
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Plasma membrane dye |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Dye solvent |
| Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) | Equipment for cell labelling and microscopy | ||
| Confocal laser scanning microscope | |||
| Ordinary computer |
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