細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定
Summary
ここでは、末梢関連タンパク質の蛍光タグ付きのプラズマ膜協会のレベルの定量的分析を実行するためのプロトコルを提案する.メソッドは、膜の計算の分解、細胞膜蛍光マーカーの付いた信号の細胞質成分に基づいています。
Abstract
このメソッドは、あらゆる蛍光タグ末梢に関連付けられている蛋白質の膜間での蛍光強度のプロファイルを使用してパーティション分割膜による高速アプローチを提供します。測定された蛍光プロファイルは、細胞周囲に対して垂直線に沿って膜と細胞質の蛍光分布モデルによる取り付けられています。このモデルは、FM 4-64-ラベルの付いた原形質膜と細胞質の蛍光タグのマーカーを発現する参照細胞の蛍光強度の値から構成されます。さまざまなセルタイプおよび生物に応用することができます。ただし、非近隣の細胞の細胞膜だけを評価できます。この顕微鏡を用いた高速メソッドは実験、細胞膜関連マーカーの微妙な動的変更が予想されるとを定量化する必要があります、例えば、阻害剤治療、蛋白質の突然変異体バージョンの分析に適して信号伝達の観察。メソッドは、ユーザーフレンドリーなインターフェイスとして機能する ImageJ マクロと結合されたマルチプラット フォーム R パッケージに実装されます。
Introduction
末梢に関連付けられている膜蛋白質は、細胞シグナル伝達経路の主要なコンポーネントです。過渡膜協会そして解離細胞膜と細胞質の間のシグナル伝達のために重要である彼らの基本的な役割の一つであります。脂質アンカー (N-ミリストイル化、アシル化、S またはプレニル化) または脂質結合ドメイン ( 、ホスファチジン酸ホスファチジルイノシトール隣酸塩との相互作用によって、細胞膜の末梢関連プラズマ膜タンパク質を取り付けることがなど)。
これらの蛋白質の特性は、プラズマ膜結合検査生体内で、例えば、蛍光タグ付きタンパク質が主要アミノ酸のサイト指示された突然変異誘発によって変更されたとき、または影響を与える様々 な阻害剤と扱われる脂質シグナリング。周辺膜蛋白質の分布主評価されている質的に、特に場合は、蛋白質の再分布が明らかなとき。提案手法は、蛋白質の再配布、部分的にしかと定量的評価が必要な状況に最適です。膜協会は共焦点から推定したときの頻繁に使用されるアプローチ レーザー走査型顕微鏡画像のない細胞膜と細胞質の1、2、蛍光強度の比が簡単なと正確になります。細胞膜での蛍光強度は、特定の蛍光顕微鏡法および光学素子の使用3の光回折特性による原形質膜と細胞質の信号の重ね合わせを反映しています。その結果、細胞内の信号は、膜領域にも含まれています。このため、膜信号選択4マスクとして FM 4-64 の染色パターンを使用できません。さらに、FM 4-64 常に体系的に最大の汚損によって定義された位置で膜信号の測定は実際膜信号の重ね合わせによる末梢関連プラズマ膜タンパク質を過大評価、膜と細胞質の化合物。末梢関連タンパク質の蛍光タグの観測信号の最大値も共同膜マーカー (すなわちFM 4-64 の styryl の染料)、最大でローカライズされていないが、細胞質にシフトします。別の制限は、FM 4-64 放出ピークは光回折3の波長依存性により GFP など緑の蛍光蛋白質のための放出のピークと比較してより広いという事実に基づく。
ここで説明したメソッド、タグ付きタンパク質の信号はそれぞれの細胞膜と細胞質シグナル仮説的分布を記述する 2 つの経験的な関数によって装着です。この信号の分解は蛍光付けられた蛋白質を表現する共焦点セクションを定期的に、2 チャンネルのソース画像で膜に垂直に細胞表面に適用される線形蛍光プロファイルに適用します。FM 4-64 染料ラベルの付いたセルです。
継ぎ手に使用される最初の関数では、セルの端に細胞質シグナルの回折について説明します。それは興味の細胞膜の末梢に関連付けられている蛋白質として同じ発色団によって付く細胞質のタンパク質マーカーを発現する細胞で測定した蛍光以前に取得したプロファイルから取得されます。プラズマ膜信号の回折を説明する 2 番目の関数は、FM 4-64 の蛍光から派生されます。この信号は、点光源の光の回折の近似モデリングに使用されているガウス関数で近似はまず。第二に、発光 FM 4-64 の有効なこのモデルは数学的に膜で興味の末梢に関連付けられている蛋白質のタグ付けに使用される色素の発光波長に関連するフォームに変換されます。両方の機能は、それぞれ最大の強度、FM 4-64 と細胞質蛋白質信号の最高値の 10% から平均が正規化されます。この信号の分解 (非線型最小正方形管継手法)、膜の比と検査された蛋白質の細胞質画分を推定できる簡単かつ正確に。膜表面濃度と細胞質の体積濃度を比較するため、分割係数の計算の実際の物理的な寸法はマイクロメータの範囲内。それは細胞膜から膜の周辺のように、同じ量のタンパク質がローカライズされて細胞質までの距離を定義します。この値は、パーティション分割を相当係数K2導入以前5。メソッドは非常に簡単で、ルーチンの共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して集録した唯一の共焦点セクションを必要として計算上要求されていません。解析コアは、ポータブルの R パッケージに実装されているし、追加の ImageJ マクロは直感的なダイアログから分析を実行するグラフィカル ユーザー インターフェイスを提供するために書かれました。ソフトウェアおよび方法の詳細な説明 (以前公開された6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/ で見つけることができます。
メソッドは単離細胞、プロトプ ラスト、組織に適した個々 の細胞の細胞膜には明確に区別できる、蛍光タグの構造を表現する末梢関連タンパク質を調べた。発色団 FM 4-64 の染色を使用する必要がありますと互換性があります。FM 4-64 発光赤;したがって、検査されたタンパク質は、青、緑、または黄色の放射 (例えばGFP、CFP、YFP) と蛍光タンパク質によるタグできます。蛋白質の分布の少ない人工より再現可能な観察を可能にするためは、生物材料の安定した変換をお勧めします。検査されたタンパク質が比較的均質な細胞質の分布を持っていることが必要です。小胞体または別の細胞内膜コンパートメントの蛋白質のローカリゼーションは、人工の結果を生成できます。
また、比較のため細胞質マーカーを表現する同じ生物学的材料を使用する必要があります。細胞は、廃止膜結合容量と無料 chomophore (周辺蛋白質、例えば、無料の GFP のタグ付けに使用されると同じ) することによって興味の蛋白質をタグに変換できます。膜結合容量廃止されることが、たとえば、膜結合ドメインのトリミングによってまたは重要なアミノ酸ボッスクカ (例えば N-ミリストイル化、アシル化、S またはプレニル化等のためのサイト) のサイト指示された突然変異誘発によって。
共焦点顕微鏡の細胞は色素 FM 4-64 のような膜マーカーによって表示しなければなりません。場合 FM 4-64 の染色 (蛍光が干渉している、貧しい染料の浸透などにより) 研究材料に適しては、原形質膜ラベル付けできますが、たとえば、適切な chomophore (タグ付き積分膜タンパク質によるmCherry、RFP、等)。マーカーでは、細胞内膜コンパートメント (膜) のごくわずかのローカリゼーションが不可欠です。
固定サンプルや抗体を操作する場合は、修正可能なアナログ FM 4-64FX または適切なターゲットに対する抗体によって分類する膜が使用できます。この場合、固定法は細胞質から細胞膜タンパク質の選択的損失につながることができますので、非常に慎重に結果を評価するために不可欠です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、膜が末梢関連タンパク質に蛍光強度5の測定に基づく他のアプローチに比べて分割のより正確な推定を生成します。このメソッドの主要な改善は、光の回折と原形質膜と細胞質の信号の重ね合わせ、考慮します。ただし、これらのメソッドの結果は、平均細胞質膜位置に蛍光強度の比較に基づく簡単な法の結果との相関 (6図以前) の?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、当社でサポートされていた私は、LO1417 (文部省、青少年、チェコ共和国のスポーツ)。
Materials
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Plasma membrane dye |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Dye solvent |
| Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) | Equipment for cell labelling and microscopy | ||
| Confocal laser scanning microscope | |||
| Ordinary computer |
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