Определение плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков
Summary
Здесь мы представляем протокол для выполнения количественный анализ уровня плазматической мембраны ассоциации дневно тегами периферически связанных белков. Метод основан на вычислительные разложение мембраны и цитоплазматических компонент сигнала, наблюдается в клетках, помечены плазматической мембраны флуоресцентных маркеров.
Abstract
Этот метод обеспечивает быстрый подход для определения плазматической мембраны перегородки любой дневно тегами периферически связанных белков с помощью профилей интенсивности флуоресценции через плазматическую мембрану. Измерений флуоресценции профили оснащены моделью распределения мембраны и цитоплазме флуоресценции вдоль линии прикладывании к периферии клетки. Эта модель построена из значения интенсивности флуоресценции в ссылочных ячеек, выражая дневно тегами маркер с FM 4-64-меченых плазматической мембраны и цитоплазме. Этот метод может применяться для различных типов клеток и организмов; Однако может оцениваться только плазменных мембран-соседних клеток. Этот метод быстро микроскопии основанные подходит для экспериментов, где ожидаются тонкие и динамических изменений маркеры плазматическую мембрану связанные и необходимость быть количественно, например, в анализе мутант версий белков, лечение ингибитором, и замечания трансдукции сигнала. Метод реализован в пакете R Multi-платформы, который соединен с ImageJ макрос, который служит удобным для пользователя интерфейсом.
Introduction
Периферически связанных плазмы мембранные белки являются ключевыми компонентами клеток, сигнальные пути. Одна из их основных ролей является их переходных плазматической мембраны ассоциации и диссоциации, который имеет важное значение для передачи сигнала между плазматической мембраны и цитоплазме. Периферически связанных плазматической мембраны белки могут быть закреплены на плазматической мембране анкерами липидов (N-myristoylation, S-ацилирования или prenylation) или липидов связывания доменов (взаимодействие с фосфатидилинозитол фосфаты, фосфатидной кислоты, и т.д.).
Плазматической мембраны привязки, свойства этих белков может быть рассмотрен в естественных условиях, например, когда белок дневно тегами изменяется с сайта Направленный мутагенез основных аминокислот, или когда он рассматривается с различных ингибиторов затрагивающих липидов сигнализации. Дистрибутивы периферийных плазмы мембранных белков основном оцениваются качественно, особенно в тех случаях, когда перераспределению белок является очевидным. Представлен метод является оптимальным для ситуаций, когда белок перераспределения только частичного и количественная оценка необходимости. Часто используемые подход когда плазматической мембраны Ассоциация оценивается от конфокальные лазерные сканирования микроскопии изображений как отношение интенсивности флуоресценции в плазматической мембраны и в цитоплазме1,2, простой, но не Точная. Интенсивностью флюоресценции в плазматической мембраны отражают суперпозиция плазматической мембраны и цитоплазме сигнала из-за дифракции света характерные для конкретного флуоресценции технику микроскопии и оптические элементы, используемые в3. Следовательно цитоплазматических сигнал включен также в регионе мембраны. По этой причине FM 4-64 окрашивание шаблон не может использоваться как маска для выбора сигнала мембраны4. Кроме того, простые измерения сигнала мембраны с позиции, определяемой FM 4-64 пятнать максимальная всегда систематически переоценивать реальные плазматической мембраны сигнал периферически связанных плазмы мембранные белки из-за наложения мембраны и цитоплазматических соединения. Максимум наблюдаемых сигналов для дневно тегами периферически связанных белков также не локализуется совместно с максимумом на плазматической мембране маркер (т.е., FM 4-64 стириловых красителей), но переносится к цитоплазме. Еще одним ограничением является что FM 4-64 пик выбросов является более широкой по сравнению с вершины выбросов для зеленых флуоресцентных белков, таких как GFP из-за дифракции света3волны зависимость.
В метод, описанный здесь протеин тегами сигнала установлен на два эмпирических функций, описывающих гипотетический распределение плазматической мембраны и цитоплазме сигнал, соответственно. Это разложение сигнала применяется линейный флуоресценции профили, которые применяются к клеточной поверхности перпендикулярно к плазматической мембране в исходных изображений, которые регулярно, 2 канальный конфокальный секции дневно тегами белка выражения клетки с FM 4-64 краска.
Первая функция, используемая для установки описывает дифракции цитоплазме сигнала на краю ячейки. Он получается из ранее приобретенного флуоресценции профилей, которые были измерены в клетках, выражая маркер белков цитоплазмы, помечены же хромофора как плазматической мембраны периферически связанных протеина интереса. Вторая функция, описывающие дифракции плазматической мембраны сигнала является производным от флуоресценции FM 4-64. Во-первых, этот сигнал аппроксимируется Гауссова функция, которая используется для приблизительной моделирование дифракции света точечного источника. Во-вторых эта модель, действительны для красных FM 4-64 выбросов, математически преобразуется в форму, которая имеет отношение к выбросов волны хромофора, используемый для пометки периферически связанных протеинов интереса на плазматической мембраны. Обе функции нормализуются путем максимальной интенсивности и среднее от 10% от высоких значений для FM 4-64 и цитоплазматических белков сигнал, соответственно. На этот сигнал разложения (нелинейный метод наименее кв установку) соотношение плазматической мембраны и цитоплазме доля обследованных белка может быть оценена легко и точно. Реальные физические измерения секционирования Вычисляемый коэффициент находится в диапазоне микрометра, потому что цитоплазматических объемной по сравнению с поверхности концентрация на плазматической мембраны. Он определяет расстояние от плазматической мембраны в цитоплазму, в течение которого такое же количество белков локализован в прилегающем районе плазматической мембраны. Это значение эквивалентно значению разделять коэффициент K2 ранее представил5. Этот метод очень быстро, требует только одного конфокальный секции, приобретенных с помощью обычной конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, и он не требует вычислений. Основной анализ был реализован в портативный пакет R и дополнительные макро ImageJ был написан предоставлять графический интерфейс пользователя для выполнения анализа из интуитивно диалоги. Программное обеспечение и более детальное описание метода (ранее опубликованы6) можно найти на http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Этот метод подходит для протопласта изолированных клеток и тканей, где ясно distinguishable плазматической мембраны отдельных ячеек, выражая дневно тегами конструкт рассмотрены периферически связанных белков. Хромофора совместим с FM 4-64 окрашивания необходимо использовать. FM 4-64 испускает красный флуоресценции; Таким образом исследуемых белков может быть помечена флуоресценции белков с синего, зеленого или желтого выбросов (например, GFP, СЛП, рекламы ЯФП). Стабильные преобразование биологического материала рекомендуется, потому, что он позволяет меньше искусственных и более воспроизводимые наблюдений белка распределения. Это необходимо изучить белка имеет сравнительно однородный цитоплазматических распределение. Локализация протеина в эндоплазматический ретикулум или другой отсек внутриклеточные мембраны может производить искусственные результаты.
Кроме того же биологический материал, выражая цитоплазматических маркер должен использоваться для сравнения. Клетки могут быть преобразованы бесплатно chomophore (так же, как используется для периферийных белка, пометки, например, бесплатные GFP) или тегами протеин интереса с отменено мембраны связывающая способность. Потенциал мембраны привязки могут быть отменены, например, путем обрезки мембраны связывающий домен или сайт Направленный мутагенез residua основных аминокислот (например, сайты для N-myristoylation, S-ацилирования, или prenylation и т.д.).
Для сканирования конфокальная микроскопия клетки должны быть помечены на мембране маркер как краситель FM 4-64. Если FM 4-64 окрашивания не подходит для материала (из-за помех аутофлюоресценция, бедных краситель проникновения и т.д.), плазматической мембраны может называться, например, неотъемлемой плазматической мембраны белка, отмеченных в соответствующие chomophore ( mCherry, ППП, и т.д.). Важно, что маркер имеет незначительный локализации в отсеках внутриклеточные мембраны (endomembranes).
При работе с фиксированной образцов и антител, может использоваться поправимо аналогового FM 4-64FX или плазматической мембраны маркировки, антитела против соответствующей цели. В этом случае важно оценить результаты очень тщательно, потому что фиксации процедур может привести к селективная потеря белков от цитоплазмы и плазматической мембраны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь генерирует более точной оценки плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков, по сравнению с другими подходами, основанный на измерении интенсивности флуоресценции5. Основные улучшения данного метода является, что он ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан НПУ I, LO1417 (Министерство образования, молодежи и спорта Чешской Республики).
Materials
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Plasma membrane dye |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Dye solvent |
| Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) | Equipment for cell labelling and microscopy | ||
| Confocal laser scanning microscope | |||
| Ordinary computer |
Riferimenti
- Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
- Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
- Kubitscheck, U. . Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).
- Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
- Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochimica. 32 (39), 10436-10443 (1993).
- Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta – Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
- Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
- Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
- Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
- Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
- Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
- Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
- Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
- Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).
