Bestämning av plasmamembranet partitionering för perifert-associerade proteiner

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en kvantitativ analys av plasmamembran föreningen för fluorescently-taggade perifert-associerade protein. Metoden är baserad på computational nedbrytning av membran och cytoplasmiska komponent signal som observerats i celler märkta med plasmamembranet fluorescerande markör.

Abstract

Denna metod ger en snabb metod för bestämning av plasmamembranet partitionering av någon fluorescently-taggade perifert-associerade protein använder profiler för fluorescensintensiteten över plasmamembranet. Uppmätta fluorescens profiler monteras av en modell för membran och cytoplasman fluorescens fördelning längs en linje tillämpas vinkelrätt till cell periferin. Denna modell är tillverkad av fluorescens intensitetsvärdena i referens celler som uttrycker en fluorescently-taggade markör för cytoplasman och med FM 4-64-märkt plasmamembranet. Metoden kan tillämpas på olika typer av celler och organismer. dock kan endast plasma membran av icke-angränsande celler utvärderas. Denna snabbt mikroskopi-baserade metod är lämplig för experiment, där subtila och dynamiska förändringar av plasmamembran-associerade markörer väntas och behöver kvantifieras, t.ex., i analysen av muterade versioner av proteiner, hämmare behandlingar, och signal transduktion observationer. Metoden är implementerad i en multi-plattform R-paket som är kopplat till ett ImageJ-makro som fungerar som ett användarvänligt gränssnitt.

Introduction

Perifert-associerade plasmamembran proteiner är de viktigaste komponenterna i cell signalering vägar. En av deras grundläggande roller är deras övergående plasmamembranet association och dissociation, vilket är viktigt för signaltransduktion mellan plasmamembranet och cytoplasman. Perifert-associerade plasmamembranet proteiner kan fästas på plasmamembranet av lipid ankare (N-myristoylation, S-acylation eller prenylation) eller av lipid bindande domäner (interagerar med fosfatidylinositol fosfater, fosfatidsyror acid, etc.).

Plasmamembran bindande egenskaper av dessa proteiner kan vara undersökt i vivo, t.ex., när ett fluorescently-taggade protein ändras genom en webbplats riktad mutagenes av viktiga aminosyror, eller när det behandlas med olika hämmare påverkar lipid signalering. Fördelningen av perifera plasma membranproteiner utvärderas mestadels kvalitativt, särskilt i fall, när protein omfördelning är uppenbart. Den presenterade metoden är optimal för situationer när protein omfördelning är endast delvis och kvantitativ utvärdering är nödvändig. En vanliga tillvägagångssätt när plasmamembranet föreningen uppskattas från confocal laser scanning mikroskopi bilder som en andel av fluorescens stödnivåer vid plasmamembranet- och i cytoplasman^1,2, är enkel, men inte korrekt. Fluorescens intensiteter på plasmamembranet återspeglar en överlagring av plasmamembran och cytoplasman signalen på grund av det lätta diffraktion kännetecknet för viss fluorescence mikroskopi teknik och optiska element används³. Följaktligen ingår den cytoplasmiska signalen också i regionen membran. Av denna anledning kan inte FM 4-64 färgning mönster användas som en mask för en membran signal urval⁴. Dessutom enkla mätningar av membran signal på den ståndpunkt som fastställts av FM 4-64 färgningen maximal alltid systematiskt överskattar riktiga plasmamembran-signalen av perifert-associerade plasma-membran protein på grund av överlagring av de membranet och cytoplasmiska förening. Maximalt antalet observerade signaler för fluorescently-taggade perifert-associerade proteiner också samtidig lokalisera inte med maximum av plasmamembranet markören (dvs, FM 4-64 styryl färgämne), men är skiftat mot cytoplasman. En annan begränsning är baserad på det faktum att FM 4-64 utsläpp peak är bredare i jämförelse med utsläpp toppar för grön fluorescerande proteiner såsom god Jordbrukarsed på grund av våglängd-beroendet av ljus diffraktion³.

I den metod som beskrivs här, monteras märkta proteinet signalen av två empiriska funktioner som beskriver en hypotetisk distribution av plasmamembran och cytoplasman signal, respektive. Denna signal nedbrytning används linjär fluorescens profiler som tillämpas på cellens yta vinkelrätt till plasmamembranet i källa bilder, som är regelbundna, två-kanals confocal delar av fluorescently-märkta proteinet uttrycker celler märkta med FM 4-64 färgämne.

Den första funktionen som används för montering beskrivs en diffraktion av cytoplasman signaler i cellen utkanten. Det erhålls från tidigare förvärvade fluorescens profiler som mättes i celler som uttrycker cytoplasma protein markör märkta av samma kromoforen som plasmamembranet perifert-associerade protein av intresse. Den andra funktionen som beskriver en diffraktion plasmamembran signal härleds från fluorescensen av FM 4-64. Denna signal är för det första tillnärmas genom en Gaussisk funktion som används för en ungefärlig modellering av light diffraction av en punktkälla. För det andra, denna modell, giltig för röda FM 4-64 utsläpp, matematiskt förvandlas till formuläret som är relevant för emissionsvåglängden kromoforen används för märkning av perifert-associerade proteiner av intresse på plasmamembranet. Båda funktionerna är normaliserade genom maximal intensitet och medelvärdet från 10% av de högsta värdena för FM 4-64 signal och cytoplasmatiska protein signal, respektive. Av denna signal nedbrytning (icke-linjära minst fyrkantig passande metod), kan förhållandet mellan plasmamembranet och cytoplasman fraktionen av proteinet undersökta uppskattas enkelt och exakt. Den verkliga fysiska dimensionen av beräknade partitionering koefficient är i spänna av mikrometer, eftersom cytoplasmiska volym koncentration jämförs med surface koncentration på plasmamembranet. Den definierar avståndet från plasmamembranet till cytoplasman, där samma mängd proteiner är lokaliserad i det närgränsande området av plasmamembranet. Detta värde motsvarar partitioneringen koefficient K₂ introducerat tidigare⁵. Metoden är mycket snabb, kräver endast enstaka confocal sektioner förvärvade använder rutinmässigt confocal laserscanning mikroskopet, och det är inte beräkningsmässigt krävande. Analys kärnan har genomförts i en bärbar R-paket och ett ytterligare ImageJ makro skrevs att tillhandahålla grafiskt användargränssnitt för att köra analysen från de intuitiva dialogrutorna. Programvara och mer detaljerad beskrivning av metoden (tidigare publicerade⁶) kan hittas på http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.

Metoden är lämplig för isolerade celler, protoplasts och vävnader, där plasmamembranet av enskilda celler är klart urskiljbara, uttrycker en fluorescently-taggade konstruktion av undersökt perifert-associerade protein. En kromofor kompatibel med FM 4-64 färgning måste användas. FM 4-64 avger röd fluorescens; undersökta protein kan därför vara märkta av ett fluorescens protein med blå, gröna eller gula utsläpp (t.ex., GFP, GFP, YFP). Stabil omvandling av biologiskt material rekommenderas eftersom det möjliggör mindre konstgjord och mer reproducerbara observationer av protein distribution. Det är nödvändigt att det undersökta proteinet har en relativt homogen cytoplasmisk fördelning. Lokaliseringen av ett protein i det endoplasmatiska retiklet eller en annan intracellulära membran kan ge konstgjord resultat.

Samma biologiska material att uttrycka en cytoplasmiska markör måste dessutom användas för jämförelse. Celler kan omvandlas genom en gratis chomophore (samma som används för perifera protein taggning, t.ex., gratis GFP) eller märkta proteinet sevärdheter med avskaffade membran bindande kapacitet. Membranet bindande kapacitet kan avskaffas, exempelvis genom trimning av membran-bindande domänen eller webbplats riktad mutagenes av viktiga aminosyran resittillstånd (e.g., platser för N-myristoylation, S-acylation, eller prenylation, etc.).

För skanning konfokalmikroskopi, måste celler märkas av en membran markör som FM 4-64 färgämne. Om FM 4-64 färgning inte är lämplig för det studera materialet (på grund av störande autofluorescens, dålig dye penetration, etc.), kan plasmamembranet märkas, exempelvis genom integrerad plasma membranprotein taggade till en lämplig chomophore ( mCherry, RFP, etc.). Det är viktigt att markören har försumbar lokalisering i de intracellulära membran fack (endomembranes).

Om arbetar med fasta prover och antikroppar, kan fastställbara analog FM 4-64FX eller plasmamembran märkning av antikroppar mot ett lämpligt mål användas. I det här fallet är det viktigt att mycket noga utvärdera resultaten eftersom fixering förfaranden kan leda till selektiv förlust av proteiner från både cytoplasman och plasmamembranet.

Protocol

1. beredning av biologiskt Material Förbereda biologiskt material att uttrycka fluorescently märkta proteinet av intresse, liksom en cytoplasmiska markör. Följa de procedurer som nämndes i inledningen. 2. confocal Microscopy för laserscanning Färga det material som beretts i avsnitt 1 med FM 4-64 dye7. Applicera en färgning protokoll som är lämplig för det studera materialet. För tobak BY-2 celler, fläcken 200 μ…

Representative Results

DREPP10 är ett anläggningsspecifika perifert-associerade plasma-membran protein som associeras med plasmamembranet via en N-myristoylation och en elektrostatisk interaktion med fosfatidylinositol fosfater11, 12. DREPP beskrevs som en komponent av Kalciumsignalering maskiner i cellen växt och samverkar också med cytoskelettet13,14. I presenterad…

Discussion

Den metod som beskrivs här ger en mer exakt uppskattning av plasmamembranet partitionering för perifert associerade proteiner jämfört med andra tillvägagångssätt baserat på mätning av fluorescens stödnivåer⁵. Större förbättring av denna metod är att det tar hänsyn till de lätta diffraktion och överlagring av plasmamembranet- och cytoplasmiska signaler. Även om dessa metod resultat i korrelation med resultaten av en enkel metod som bygger på jämförelse av fluorescensintensitet…

Materials

FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Plasma membrane dye
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)			Equipment for cell labelling and microscopy
Confocal laser scanning microscope
Ordinary computer