Qui, presentiamo un protocollo per misurare la virulenza dei batteri planctonici o collegata alla superficie mediante d. discoideum (ameba) come un ospite. Virulenza viene misurato su un periodo di 1 h e host uccidendo è quantificata mediante analisi di immagine e microscopia di fluorescenza. Dimostriamo questo protocollo utilizzando il batterio p. aeruginosa.
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Articolo metodologico
Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba
In questo articolo
Sommario
Abstract
Saggi di virulenza batterica tradizionale coinvolgono l'esposizione prolungata dei batteri nel corso di diverse ore per le celle. Durante questo periodo, i batteri possono subire cambiamenti nella fisiologia a causa dell'esposizione all'ambiente di crescita di host e la presenza di cellule dell'ospite. Abbiamo sviluppato un test per misurare rapidamente lo stato di virulenza dei batteri che riducono al minimo l'entità a cui i batteri crescono in presenza di cellule dell'ospite. Batteri e amebe sono mescolate insieme e immobilizzate su un unico piano di formazione immagine usando un tampone di agar. La procedura utilizza l'imaging di fluorescenza di cella singola con calceina-acetossimetil estere (calceina-AM) come indicatore di salute della cellula ospite. La fluorescenza delle cellule dell'ospite viene analizzata dopo 1 h di esposizione delle cellule dell'ospite ai batteri utilizzando epifluorescenza. Software di analisi di immagine viene utilizzato per calcolare un indice di abbattimento di host. Questo metodo è stato utilizzato per misurare la virulenza all'interno planctonici e collegata alla superficie Pseudomonas aeruginosa sottopopolazioni durante la fase iniziale di formazione del biofilm e può essere adattato ad altri batteri e altre fasi di crescita di biofilm. Questo protocollo fornisce un metodo rapido e robusto di virulenza di misura ed evita molte delle complessità associati alla crescita e la manutenzione di linee cellulari di mammifero. Fenotipi di virulenza qui misurati utilizzando le amebe sono stati convalidati anche utilizzando i macrofagi del topo. In particolare, questa analisi è stata usata per stabilire tale virulenza sopraregola collegamento di superficie in p. aeruginosa.
Introduzione
Infezione batterica è una delle principali cause di mortalità in umani e animali1,2. La capacità di misurare la virulenza dei batteri in culture o biofilm è importante nelle impostazioni di ricerca e assistenza sanitaria. Qui, descriviamo un metodo versatile, veloce e relativamente semplice per quantificare la virulenza batterica. L'organismo eucariote Dictyostelium discoideum (ameba) viene utilizzato come organismo modello ospite. D. discoideum è stato utilizzato come un host di identificare i fattori di virulenza di Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso la University of California, Irvine.
1. tamponi e soluzioni
- Preparare Lisogenesi brodo (LB) in una bottiglia di vetro 1L aggiungendo 25 g di mix LB-Miller in 1 L di acqua bidistillata (ddH2O). Per piastre di Petri, aggiungere un ulteriore 20 g di agar. Autoclave per sterilizzare. Versare 25 mL di terreno agar fuso in 10 cm-Diametro piastre di Petri e lasciare solidificare a temperatura ambiente. Archivio media liquidi a temperatura ambiente e piastre di agar a 4 ° C.
- Preparare piatti di glucosio lievito Peptone (GYP) in una bottiglia di vetro 1L mesc....
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Risultati
Siamo cresciuti selvaggio-tipo p. aeruginosa ceppo PA1419 o un Δieri ceppo20 allo stesso sfondo PA14 in capsule di 6 Petri cm di diametro e analizzato la virulenza delle cellule planctoniche e collegata alla superficie. Culture sono stati inoculati da single-colonie nel PS:DB culture, cresciute durante la notte in provette di coltura in un rullo di tamburo a 37 ° C alla saturazione, diluito 1: 100 in PS:DB, coltivate per 8 .......
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Discussione
Questo protocollo descrive un metodo veloce e quantitativo per analizzare la virulenza di p. aeruginosa. Questo protocollo può essere testato con altri batteri. Tuttavia, è importante tenere a mente che il mezzo di crescita dovrebbe essere compatibile con le condizioni di crescita di ameba. In particolare, abbiamo ottimizzato il protocollo usando PS:DB come mezzo di crescita batterica. Se vengono utilizzati altri supporti, può essere necessario eseguire un controllo di sola media di crescita in cui non sono pres.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
KP e AS ha scritto e rivisto il manoscritto. KP eseguito gli esperimenti e l'analisi. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) carriera transizione premio (K22AI112816) per As
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| Bacto agar, disidratato | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotico-Antimicotico (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL e conservare a -20 ° C |
| Calceina-acetossimetile estere (calceina-AM) | Life Technologies | C34852 | Calceina Acetossimetile (AM) |
| Cloruro di calcio, anidro | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-glucosio | Fisher Chemical | D16500 | Destrosio |
| Dimetil solfossido | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Acido folico | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Estratto di lievito | Oxoid | LP0021 | |
| Peptone speciale | Oxoid | LP0072 | |
| Irossido di potassio | Fisher Chemical | P250 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodio fosfato bibasico eptaidrato | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamina B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Ceppo AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Ceppo B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | ceppo19 |
| Pseudomonas aeruginosa & Delta; lasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | Ceppo derivato da PA1420 |
| Supplies | |||
| 0.22 &; m filtro | Millipore | SCGPT01RE | Per la sterilizzazione con filtro Tubo |
| conico, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Flaconi di vetro | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Piastra di Petri, diametro 6 cm | Corning | 351007 | Piastre in polistirolo 60 x 15 mm |
| Piastra Petri, diametro 10 cm | Fisher | FB0875712 | Piastre in polistirene 100 x 15 mm |
| Contenitori in plastica con coperchio | Ziploc | 2.57E+09 | Contenitori quadrati da 3 tazze |
| Piatti in vetro | Bio-Rad | 1653308 | Per la preparazione di tamponi di agar. Possono essere utilizzate altre lastre di vetro con dimensioni simili. |
| Bastoncini di legno | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscopio | Nikon | MEA53100 | Configurazione del microscopio |
| 10X Plan Fluor Ph1 obiettivo 0,3 NA | Nikon | MRH20101 | Configurazione del microscopio |
| Sorgente di eccitazione della fluorescenza | Lumencor | Sola light engine | Configurazione del microscopio |
| Set di filtri a fluorescenza | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Configurazione del microscopio |
| Fotocamera Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | 77054098 | Configurazione del microscopio |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software per l'analisi delle immagini |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software per l'analisi delle immagini |
| Incubatore con agitatore orbitale | VWR | 89032-092 | Per la crescita di batteri a 37 gradi C |
| Agitatore a piattaforma | Fisher | 13-687-700 | Per la crescita di amebe a 22 gradi C |
| Spettrofotometro | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Incubatore refrigerato sottopiano | Fisher | 97990E | Per la crescita di amebe a 22 gradi C |
| Isotemp bagnomaria | Fisher | 15-462-21Q | Per fluidi di raffreddamento fino a 55 gradi E |
Riferimenti
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology<....
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Ristampe e permessi
