В естественных условиях Nanovector поставка сердца конкретных микроРНК Губка
Summary
Ингибирование ткани конкретных микроРНК — это технология, развита в поле микроРНК. Здесь мы описываем протокол успешно подавляют микроРНК miR-181 семьи в myoblast клетки от сердца. Nanovector технология используется для доставки микроРНК Губка, которая демонстрирует значительный в vivo кардио конкретных мир-181 семьи ингибирование.
Abstract
МикроРНК (miRNA) небольшой некодирующих РНК, которая препятствует выражение post-transcriptional матричная РНК (мРНК). Заболеваний человека, таких как рак и сердечно-сосудистых заболеваний, было показано, чтобы активировать ткани или клетки конкретных Мирна выражение, связанное с прогрессирования заболевания. Ингибирование Мирна выражения предлагает возможности для терапевтического вмешательства. Однако традиционные подходы к препятствовать адаптивной, используя antagomir олигонуклеотиды, влияют на функции конкретных Мирна после глобальной доставки. Здесь мы представляем протокол для ингибирования кардио конкретных в естественных условиях , мир-181 семьи в мышиной модели. Мирна Губка конструкция предназначена для включают 10 повторной привязки miR-181 последовательности. Кардио конкретных α-MHC промоутер клонируется в pEGFP позвоночника диск кардио конкретных мир-181 Мирна Губка выражение. Для создания стабильного ячейки линии выражая мир-181-Губка, myoblast H9c2 клетки являются transfected с α-MHC-EGFP-miR-181-sponge конструкцией и отсортированных по активации флуоресценции клеток, сортируя (FACs) в GFP положительные H9c2 клетки, которые культивировали с неомицин (G418). После стабильный рост в неомицин моноклональных клеточных популяций устанавливаются дополнительные СУИМ и одноклеточного клонирования. Результате клетки myoblast H9c2-мир-181-Губка GFP экспонат потеря функции членов семьи мир-181, как оценивать через увеличение выражение мир-181 целевых белков и по сравнению с H9c2 клеток, выражая схватка нефункциональные губкой. Кроме того мы разрабатываем nanovector для системных доставки построим мир-181-Губка, комплексообразующие положительно заряженных липосомальных наночастиц и отрицательно заряженные мир-181-Губка плазмид. В естественных условиях изображений GFP показывает, что множественные инъекции хвост вен nanovector в течение трех недель способны содействовать значительным проявлением мир-181-Губка в кардио конкретным образом. Важно отметить, что потеря функции мир-181 наблюдается в тканях сердца, но не в функции почек или печени. Мирна Губка-это мощный метод для подавления Мирна ткани конкретного выражения. Вождение Мирна Губка выражение из ткани конкретной промоутера обеспечивает специфичности для ингибирования Мирна, которые могут ограничиваться целевых органа или ткани. Кроме того сочетание nanovector и Мирна Губка технологий позволяет эффективной доставки и ткани конкретных Мирна ингибирование в естественных условиях.
Introduction
За последние два десятилетия были многочисленные исследования, которые указали на важную роль адаптивной в болезни человека. Выводы из большого количества литературы демонстрируют бесспорную важность интерферирующим в патофизиологии таких заболеваний, как рак1 и сердечно-сосудистых заболеваний2,3,4,5. К примеру мир-21-upregulated во многих раках, что приводит к увеличению клеток и клеточного цикла распространения6. В инфекции гепатита С мир-122 играет важную роль в репликации вируса7, и было показано, что ингибирование мир-122 снижает вирусную нагрузку8. В гипертрофии сердца мир-212/132-upregulated в самом сердце и участвует в патологический фенотип9. Очевидное значение Даунрегуляция или функциональной ингибитирование upregulated miRNA предлагает возможности для терапевтически эксплуатации Мирна биологии в практически всех заболеваний.
Четыре члена семьи мир-181, мир 181a/b/c/d, находятся в трех местах геномной в геноме человека. Intronic региона некодирующих хост гена РНК (MIR181A1-HG) кодирует кластер мир-181-a/b-1. Intronic область NR6A1 ген кодирует мир-181-a/b-2. Мир-181-c/d кластер расположен в uncharacterized транскрипт на хромосоме 19. Все члены семьи мир-181 поделиться той же последовательности «семян» и все четыре члена семьи мир-181 потенциально может регулировать же мРНК-мишеней.
Мы3,4 и другие10 высветили важность мир-181 членов семьи в течение последней стадии сердечной недостаточности. Мы также признали, что мир – 181c upregulation происходит в патологических условиях, связанных с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, например диабета II типа, ожирение и старения3,4,5. Постулируется, что гиперэкспрессия мир – 181c вызывает оксидативного стресса, что приводит к дисфункции сердца4.
Несколько групп предложили что Мирна существуют в митохондриях11,12,13,14, но мы были первыми, чтобы продемонстрировать, что мир – 181 c является производным от ядерного генома, обрабатываются, и впоследствии арестовано митохондрий в RISC3. Кроме того мы обнаружили выражение низкий мир 181a и мир 181b в отсеке митохондриальной сердца5. Важно отметить, что мы нашли что мир – 181 c подавляет выражение mRNA mt-COX1, так, продемонстрировав тем самым интерферирующим участвуют в регуляции митохондриальных генов и изменить функции митохондрий3,4.
Эта статья обсуждает методологии, необходимых для разработки Мирна губкой, чтобы постучать вниз весь мир-181 семьи в кардиомиоцитов. Кроме того мы приводим протокол для применения в естественных условиях мир-181-Губка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья описал дизайн и синтез губкой Мирна и продемонстрировал, как ткани конкретным выражением Губка является мощным инструментом для ингибирования ткани специфические Мирна семьи выражение.
Мы продемонстрировали, что мир-181 семьи против Губка можно клонировать в …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Энтони K. L. Leung Кафедра биохимии и молекулярной биологии, Блумбергской школой общественного здравоохранения, Университет Джона Хопкинса для его технической помощи с проектирование конструкции мир-181-Губка. Мы также благодарим Полина Сыса-Шах и Кэтлин Габриелсон отдела молекулярной и сравнительной Pathobiology, Джонс Хопкинс медицинских учреждений для их технической помощи изображений в естественных условиях доставки Мирна Губка.
Эта работа было поддержано грантов из низ, HL39752 (для Charles Steenbergen) и ученый развития гранта от Американской ассоциации сердца 14SDG18890049 (до Samarjit дас). Крыса кардио конкретной промоутера щедро предоставляемые Джеффри D. Molkentin в Цинциннати детской больнице.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
Riferimenti
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
