वीवो में एक दिल विशेष MicroRNA-स्पंज की Nanovector डिलिवरी
Summary
ऊतक विशिष्ट microRNA अवरोध एक तकनीक है कि microRNA क्षेत्र में विकसित की है । इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सफलतापूर्वक myoblast कोशिकाओं में दिल से मीर-१८१ microRNA परिवार को बाधित । Nanovector प्रौद्योगिकी एक microRNA स्पंज कि vivo कार्डियो विशिष्ट मीर-१८१ परिवार निषेध में महत्वपूर्ण दर्शाता है उद्धार करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Abstract
MicroRNA (miRNA) छोटे गैर कोडिंग आरएनए जो पोस्ट-transcriptional दूत आरएनए (mRNA) अभिव्यक्ति को रोकता है । मानव रोगों, जैसे कैंसर और हृदय रोग, रोग प्रगति के साथ जुड़े ऊतक और/या कोशिका-विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है । miRNA अभिव्यक्ति की बाधा एक चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए क्षमता प्रदान करता है । हालांकि, पारंपरिक दृष्टिकोण miRNAs को बाधित करने के लिए, antagomir oligonucleotides रोजगार, वैश्विक वितरण पर विशिष्ट miRNA कार्यों को प्रभावित । इस के साथ साथ, हम vivo कार्डियो में एक चूहा मॉडल में मीर-१८१ परिवार के विशेष निषेध के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक miRNA-स्पंज का निर्माण 10 दोहराया विरोधी मीर-१८१ बाध्यकारी दृश्यों को शामिल करने के लिए बनाया गया है । कार्डियो-विशिष्ट α-MHC प्रमोटर pEGFP रीढ़ में क्लोन है कार्डियो विशिष्ट मीर-१८१ miRNA-स्पंज अभिव्यक्ति ड्राइव । एक स्थिर सेल एक्सप्रेस मीर-१८१-स्पंज, myoblast H9c2 कोशिकाओं के साथ transfected रहे है बनाने के लिए α-MHC-EGFP-मीर-१८१-स्पंज का निर्माण और प्रतिदीप्ति द्वारा क्रमबद्ध-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACs) GFP सकारात्मक H9c2 कोशिकाओं में जो निओमायसिन के साथ संस्कृति रहे हैं (G418) । निओमायसिन में स्थिर विकास के बाद, मोनोक्लोनल सेल आबादी अतिरिक्त FACs और एकल सेल क्लोनिंग द्वारा स्थापित कर रहे हैं । जिसके परिणामस्वरूप myoblast H9c2-मीर-१८१-स्पंज-GFP की कोशिकाओं मीर के समारोह के नुकसान का प्रदर्शन-१८१ परिवार के सदस्यों के रूप में मीर की वृद्धि की अभिव्यक्ति के माध्यम से मूल्यांकन-१८१ लक्ष्य प्रोटीन और H9c2 एक हाथापाई गैर कार्यात्मक स्पंज व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में । इसके अलावा, हम मीर के प्रणालीगत प्रसव के लिए एक nanovector-१८१-स्पंज जटिल सकारात्मक आरोप लगाया liposomal नैनोकणों और नकारात्मक मीर-१८१-स्पंज plasmids आरोप लगाया द्वारा निर्माण का विकास । vivo इमेजिंग में GFP से पता चलता है कि एक तीन सप्ताह की अवधि में एक nanovector के कई पूंछ नस इंजेक्शन एक कार्डियो विशेष तरीके से मीर-१८१-स्पंज की एक महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने में सक्षम हैं । महत्वपूर्ण बात, मीर-१८१ समारोह का नुकसान दिल के ऊतकों में नहीं बल्कि गुर्दे या जिगर में मनाया जाता है । miRNA-स्पंज ऊतक विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । एक ऊतक से miRNA-स्पंज अभिव्यक्ति ड्राइविंग-विशिष्ट प्रमोटर miRNA अवरोध, जो एक लक्षित अंग या ऊतक तक ही सीमित किया जा सकता है के लिए विशिष्टता प्रदान करता है । इसके अलावा, nanovector और miRNA-स्पंज प्रौद्योगिकियों के संयोजन एक प्रभावी वितरण और vivo मेंऊतक विशिष्ट miRNA निषेध परमिट ।
Introduction
पिछले दो दशकों में, वहां कई अध्ययनों कि मानव रोग में miRNAs की महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा किया गया है । साहित्य के एक बड़े शरीर से निष्कर्षों रोगों के pathophysiology में miRNAs के निर्विवाद महत्व को प्रदर्शित करता है, ऐसे कैंसर के रूप में1 और हृदय रोग2,3,4,5. उदाहरण के लिए, मीर-21 कई कैंसर में विनियमित है, एक वृद्धि हुई कोशिका चक्र और सेल प्रसार6में जिसके परिणामस्वरूप । हेपेटाइटिस सी संक्रमण में, मीर-१२२ वायरस7की प्रतिकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और यह दिखाया गया है कि मीर के निषेध-१२२ वायरल लोड8घट जाती है । कार्डियक अतिवृद्धि में, मीर-212/132 दिल में विनियमित है और रोग phenotype9में शामिल है । downregulation या एक अनियमित miRNA के कार्यात्मक निषेध के स्पष्ट महत्व चिकित्सकीय लगभग सभी रोगों में miRNA जीवविज्ञान का दोहन करने के लिए अवसरों का सुझाव है ।
चार मीर-१८१ परिवार के सदस्य, मीर-181a/बी/सी/डी, मानव जीनोम में तीन जीनोमिक स्थानों में पाए जाते हैं. एक गैर कोडिंग आरएनए मेजबान जीन (MIR181A1-पारा) के intronic क्षेत्र में encodes मीर के क्लस्टर-181-a/b-1 । NR6A1 जीन के intronic क्षेत्र में encodes मीर-181-a/b-2 । मीर-181-सी/डी क्लस्टर गुणसूत्र 19 पर एक विलक्षण प्रतिलिपि में स्थित है । सभी मीर-१८१ परिवार के सदस्यों को एक ही “बीज” अनुक्रम का हिस्सा है और सभी चार मीर-१८१ परिवार के सदस्यों को संभवतः एक ही mRNA लक्ष्य को विनियमित कर सकते हैं ।
हम3,4 और अंय10 मीर के महत्व को उजागर किया है-१८१ परिवार के सदस्यों को अंतिम चरण के दिल की विफलता के दौरान । हम यह भी मांयता प्राप्त है कि एक मीर-181c विनियमन रोग स्थितियों जैसे द्वितीय मधुमेह, मोटापा, और उंर बढ़ने3,4,5के रूप में हृदय रोग का एक बढ़ा जोखिम से संबंधित के तहत होता है । यह माने किया गया है कि मीर के व्यक्त-181c ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनता है जो एक हृदय रोग की ओर जाता है4।
कई समूहों का सुझाव दिया है कि miRNA mitochondria11,12,13,14में मौजूद है, लेकिन हम पहले प्रदर्शन है कि मीर-181c परमाणु जीनोम, संसाधित से व्युत्पंन है, और बाद में RISC3में mitochondria को translocated । इसके अलावा, हम5दिल के mitochondrial डिब्बे में मीर-181a और मीर-181b की एक कम अभिव्यक्ति का पता चला है । महत्वपूर्ण बात, हमने पाया है कि मीर-181c मीट्रिक टन-COX1 mRNA अभिव्यक्ति, जिससे कि miRNAs mitochondrial जीन विनियमन में भाग लेने और mitochondrial समारोह3,4परिवर्तन दमित ।
इस अनुच्छेद के लिए एक miRNA-स्पंज के लिए नीचे पूरे मीर दस्तक-१८१ cardiomyocytes में परिवार डिजाइन आवश्यक पद्धति पर चर्चा की । इसके अलावा, हम में vivo आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा मीर-१८१-स्पंज ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद के डिजाइन और एक miRNA-स्पंज के संश्लेषण का वर्णन किया है और कैसे ऊतक स्पंज की विशिष्ट अभिव्यक्ति का प्रदर्शन ऊतक विशिष्ट miRNA परिवार अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Leung जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान विभाग, ब्लूमबर्ग पब्लिक हेल्थ के स्कूल, जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय के डिजाइन के साथ अपनी तकनीकी मदद के लिए कश्मीर-१८१-स्पंज के निर्माण के लिए धंयवाद एंथोनी के एल । हम भी Polina Sysa-शाह और आणविक और तुलनात्मक Pathobiology विभाग के कैथलीन Gabrielson, जॉंस हॉपकिंस चिकित्सा संस्थानों miRNA-स्पंज डिलीवरी के vivo इमेजिंग में द्वारा उनकी तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।
यह काम NIH, HL39752 (चार्ल्स Steenbergen को) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 14SDG18890049 (समरजीत दास को) से एक वैज्ञानिक विकास अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । चूहे कार्डियो विशेष प्रमोटर उदारता Jeffery Molkentin द्वारा सिनसिनाटी चिल्ड्रन अस्पताल में प्रदान की गई थी ।
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
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