Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품
Summary
조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.
Abstract
예측에 관한 (미르)은 작은 비 코딩 RNA는 post-transcriptional 메신저 RNA (mRNA) 식 억제. 인간의 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 같은 조직 및/또는 질병 진행과 관련 된 셀 전용 미르 식 활성화를 표시 되었습니다. MiRNA 식의 억제 치료 적 개입에 대 한 가능성을 제공합니다. 그러나, miRNAs, antagomir oligonucleotides 채용을 억제 하는 기존의 방법과 글로벌 배달 시 특정 miRNA의 기능에 영향을. 여기, 우리가 쥐 모델에서 미르-181 가족의 비보에 심장 관련 금지에 대 한 프로토콜을 제시. 미르-스폰지 구조는 10 반복된 안티 miR-181 바인딩 시퀀스를 포함 하도록 설계 되었습니다. 심장 관련 α-MHC 발기인은 심장 관련 미르-181 미르-스펀지 식 드라이브를 pEGFP 등뼈에 복제 됩니다. 안정적인 셀을 만들려면 미르-181-스폰지, myoblast H9c2 셀을 표현 하는 라인 α-MHC-EGFP-miR-181-sponge 구조와 페 되 고 형광 활성화 된 세포 (FACs) 네오 마이 신으로 교양 GFP 긍정적인 H9c2 세포로 정렬 하 여 정렬 (G418)입니다. 네오 마이 신에 안정적인 성장, 단일 클로 널 세포 인구 추가 FACs 및 단일 세포 복제에 의해 설립 됩니다. 결과 myoblast H9c2-미르-181-스폰지-GFP 셀 미르-181 대상 단백질의 증가 된 표현을 통해 평가 미르-181 가족 구성원의 기능의 손실을 전시 하 고 출 격 비 기능 스폰지를 표현 하는 H9c2 세포에 비해. 또한, 우리는 complexing 긍정적으로 자주 나노 입자를 충전 하 고 부정적으로 위탁 미르-181-스폰지 플라스 미드에 의해 미르-181-스폰지 구문의 체계적 전달에 대 한 nanovector를 개발 한다. GFP의 이미징 vivo에서 3 주 기간 동안에 nanovector의 여러 꼬리 정 맥 주사는 심장 특정 방식으로 미르-181-스폰지의 중요 한 식 홍보 수 있습니다 밝혀. 중요 한 것은, 미르-181 기능의 상실 심 혼 직물에는 신장 이나 간만 관측 된다. 미르-스폰지 조직 관련 미르 식 억제 하는 강력한 방법입니다. 미르-스폰지 식 조직 특정 발기인에서 운전 대상된 기관 또는 조직에 국한 될 수 미르 저해에 대 한 특이성을 제공 합니다. 또한, nanovector 및 미르-스폰지 기술을 결합 한 효과적인 배달 및 조직 관련 미르 저해에서 vivo에서허용 합니다.
Introduction
지난 2 년간 인간의 질병에 miRNAs의 중요 한 역할을 지적 하는 수많은 연구 되었습니다. 문학의 큰 몸 결과 miRNAs 질병, 암1 등 심혈 관 질환2,3,,45의 이상에의 명백한 중요성을 보여 줍니다. 예를 들어, 미르-21는 증가 세포 주기, 세포 확산6결과 많은 암에 upregulated입니다. C 형 간염 감염에서 미르-1227바이러스 복제에 중요 한 역할 하 고 미르-122의 저해 바이러스 부하8감소 표시 되었습니다. 심장 비 대에서 미르-212/132에에서 upregulated 이며 병 적인 표현 형9에 관여. downregulation의 명백한 중요성 또는 upregulated miRNA의 기능 억제 치료로 거의 모든 질병에 미르 생물학을 악용에 대 한 기회를 제안 합니다.
4 미르-181 가족 구성원, 미르-181a/b/c/d, 인간 게놈에 있는 3 개의 genomic 위치에서 찾을 수 있습니다. 비 코딩 RNA 호스트 유전자 (MIR181A1-HG)의 intronic 지역 미르-181-a/b-1의 클러스터를 인코딩합니다. NR6A1 유전자의 intronic 지역 미르-181-a/b-2를 인코딩합니다. 미르-181-c/d 클러스터는 염색체 19에 새롭거나 사본에 있습니다. 모든 미르-181 가족 같은 “씨앗” 시퀀스를 공유 하 고 모든 4 명의 미르-181 가족 구성원 잠재적으로 동일한 mRNA 표적을 통제할 수 있다.
우리3,4 등10 말기 심장 마비 동안 미르-181 가족의 중요성을 강조 했다. 우리는 또한 미르-181 c upregulation는 타입 II 당뇨병 등 심장 질환의 위험 증가, 비만, 노화3,,45와 관련 된 병 적인 조건 하에서 발생 하는 것을 인식 했다. 그것은 overexpression 미르-181 c의 산화 스트레스는 심장 부전4에 이르게 하면 가정 되었습니다.
미토 콘 드리 아11,12,,1314에 존재 하는 miRNA 하지만 우리 미르-181 c 처리, 핵 게놈에서 파생 된 증명을 최초로 여러 그룹 제안 및 그 후 translocated RISC3에서 미토 콘 드리 아에. 또한, 우리 심장5의 미토 콘 드리 아 구획에 181a 미르와 미르-181b 낮은 식을 감지 했습니다. 중요 한 것은, 우리는 발견 그 미르-181 c 누르는 mt COX1 mRNA 식 miRNAs 미토 콘 드리 아 유전자 규칙에 참여 하 고 미토 콘 드리 아 기능3,4를 변경 함으로써 시연.
이 문서는 cardiomyocytes에 미르-181 가족 전체를 허물고 미르-스폰지를 디자인 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다. 또한, 우리 미르-181-스폰지의 비보에 응용 프로그램에 대 한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서 설계 및 합성 미르-스폰지의 설명 하 고 어떻게 조직 전용 스폰지의 식이 조직 관련 미르 가족 식 억제 하는 강력한 도구 설명.
우리 심장 전용 모터와 스폰지를 대상으로 하는 미르-181 가족 식 플라스 미드로 복제 될 수 있습니다 설명 했다. 플라스 미드를 효율적으로 전달에 대 한 nanovector 입자에 포장 될 수 있다 생체 외에서 그리고 vivo에서 각각 electropor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 학과의 생화학 및 분자 생물학의 안토니 K. L. 렁 감사, 블룸버그 공중 보건의, 존스 홉킨스 대학 그의 기술에 대 한 미르-181-스폰지 구조 설계 도움. 우리는 또한 한국 Sysa-샤와 부의 분자와 비교 Pathobiology, 미르-스폰지 배달의 vivo에서 화상 진 찰에 의해 그들의 기술 지원에 대 한 존스 홉킨스 의료 기관의 캐슬 린 Gabrielson 감사합니다.
이 작품은 NIH, (찰스 스 틴 버 켄)를 HL39752에서에서 교부 금에 의해 그리고 과학자 개발에서에서 교부 금 미국 심장 협회 14SDG18890049 (Samarjit Das)에 의해 지원 되었다. 쥐 심장 관련 발기인 아낌없이 제프리 D. Molkentin 신시내티 아동 병원에 의해 제공 되었다.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
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