JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Vivo Nanovector teslim kalp özel mikroRNA-sünger

Published: June 15, 2018
doi:
10.3791/57845
, ,
1Princess Margaret Cancer Centre,University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology,Johns Hopkins University

Summary

Doku özel mikroRNA inhibisyon mikroRNA alanında az gelişmiş bir teknolojidir. Burada, biz başarılı bir şekilde myoblast hücreleri miR-181 mikroRNA ailesinde kalp etkisizleştirmek için bir protokol tanımlamak. Nanovector teknoloji önemli vivo kardiyo özgü miR-181 aile inhibisyon gösteren sünger bir mikroRNA amacıyla kullanılabilir.

Abstract

MikroRNA (miRNA) küçük çoğu mesajcı RNA (mRNA) ifade inhibe RNA kodlamayan. İnsan hastalıkları, kanser ve kardiyovasküler hastalık, gibi doku ve/veya hastalık ilerlemesi ile ilişkili hücre özgü miRNA ifade etkinleştirmek gösterilmiştir. MiRNA ifade inhibisyonu bir terapötik müdahale için potansiyel sunmaktadır. Ancak, miRNAs, antagomir oligonucleotides, istihdam etkisizleştirmek için geleneksel yaklaşımlar belirli miRNA işlevleri küresel teslim üzerine etkiler. Burada, bir sıçan modelinde bir protokol miR-181 aile içinde vivo kardiyo özgü inhibisyonu için mevcut. MiRNA-sünger yapı 10 tekrarlanan miR-181 bağlayıcı sıraları içerecek şekilde tasarlanmıştır. Kardiyo özgü α-MHC organizatörü kardiyo özgü miR-181 miRNA-sünger ifade sürmeyi pEGFP omurga klonlanmış. İstikrarlı bir hücre oluşturmak için ifade miR-181-sünger, myoblast H9c2 hücre satırı sahip α-MHC-EGFP-miR-181-sponge yapı transfected ve floresan aktif hücre paromisin ile kültürlü GFP olumlu H9c2 hücre içine (FACs) sıralama göre sıralanmış (G418). Paromisin istikrarlı büyüme, monoklonal hücre popülasyonlarının ek FACs ve tek hücre klonlama tarafından oluşturulur. Elde edilen myoblast H9c2-miR-181-sünger-GFP hücreleri yoluyla miR-181 hedef proteinlerin ifade artan değerlendirildi gibi miR-181 aile üyelerinin fonksiyon kaybı sergi ve kapış işlevsel olmayan sünger ifade H9c2 hücrelere kıyasla. Buna ek olarak, tarafından olumlu liposomal nano tanecikleri kullanılıyorsa ve olumsuz miR-181-sünger plazmid tahsil kompleks bir nanovector miR-181-sünger yapı sistemik teslim etmek için geliştirmek. GFP in vivo görüntüleme bir nanovector, üç haftalık süre içinde birden fazla kuyruk ven enjeksiyonları miR-181-sünger önemli bir ifade bir kardiyo özgü şekilde tanıtmak mümkün olduğunu ortaya koymaktadır. Önemlisi, miR-181 fonksiyon kaybı kalp doku ama böbrek veya karaciğer içinde görülmektedir. MiRNA-sünger doku özgü miRNA ifade etkisizleştirmek için güçlü bir yöntemdir. MiRNA-sünger ifade bir doku özgü organizatörü sürüş özgüllük bir hedef organ veya doku binayla miRNA inhibisyonu için sağlar. Ayrıca, nanovector ve miRNA-sünger teknolojileri birleştirerek bir etkili teslim ve doku özgü miRNA inhibisyon vivo içindeverir.

Introduction

Son yirmi yılda insan hastalığında miRNAs önemli rol işaret çok sayıda çalışma yapılmıştır. Edebiyatı büyük gövdeli bulgular miRNAs kanser1 ve kardiyovasküler hastalık2,3,4,5gibi hastalıkların Patofizyoloji yadsınamaz önemini göstermek. Örneğin, miR-21 upregulated birçok kanserleri, sonuçlanan bir artan hücre döngüsü ve hücre proliferasyonu6‘ dir. Hepatit C enfeksiyonu, miR-122 virüs7çoğaltma içinde önemli bir rol oynar ve miR-122 inhibisyonu viral yük8azalır kanıtlanmıştır. İçinde kalp hipertrofisi, miR-212/132 upregulated ‘ kalbinde ve patolojik fenotip9‘ ilgilenmektedir. Bariz önemini downregülasyon ya da işlevsel bir upregulated miRNA inhibisyonu tedavi amaçlı hemen hemen tüm hastalıklar miRNA biyolojide istismar için fırsatlar öneriyor.

Dört miR-181 aile üyeleri, miR-181a/b/c/d, insan genomu üç genomik konumlarda bulunur. Kümenin miR-181-a/b-1’in bir kodlamayan RNA ana bilgisayar gen (MIR181A1-HG) intronic bölge kodlar. NR6A1 gen intronic bölge miR-181-a/b-2 kodlar. MiR-181-c/d küme uncharacterized bir transkript kromozom 19 üzerinde yer alır. Tüm miR-181 aile üyeleri aynı “tohum” sıra paylaşmak ve tüm dört miR-181 aile üyeleri büyük olasılıkla aynı mRNA hedefleri düzenleyen.

Biz3,4 ve diğerleri10 önemini miR-181 aile fertleri sırasında son aşama kalp yetmezliği parlak nokta. MiR – 181 c upregulation bir tip II diyabet gibi kalp hastalığı riski, obezite ve yaşlanma3,4,5ile ilişkili patolojik şartlar altında gerçekleşir de tanımış. Overexpression miR – 181 c kardiyak disfonksiyon4‘ e uzanan oksidatif stres nedenleri öne.

Çeşitli gruplar miRNA mitokondri11,12,13,14‘ te var, ama o miR – 181 c işlenen, nükleer genom türetilmiştir göstermek için ilk tavsiye ettiler ve sonradan mitokondri RISC3için translocated. Ayrıca, kalp5mitokondrial kompartımanda miR-181a ve miR-181b düşük bir ifade tespit etti. Da önemlisi, o miR – 181 c mt-COX1 mRNA ifade represses böylece miRNAs mitokondrial gen düzenlemesi katılmak ve mitokondriyal işlev3,4alter gösteren bulduk.

Bu makalede cardiomyocytes tüm miR-181 ailesinde aşağı vurmak için bir miRNA sünger tasarlamak için gerekli yöntemi anlatılmaktadır. Ayrıca, bir protokol miR-181-sünger vivo içinde uygulanması için anahat.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. sünger tasarım MikroRNA 3′ UTR bağlamaNot: A miRNA işlevleri belirli temel eşleştirme etkileşimlerin 3′ çevrilmeyen bölgesi (UTR) kısmen tamamlayıcı siteleri ile onun hedef mRNA’ların aracılığıyla (kapsamlı bir inceleme için bkz: Bartel)15. MiRNA ifade olarak önemli tamamlayıcıl…

Representative Results

Stabil transfected pEGFP-miR-181-sünger-ifade H9c2 hücrelerinde (Kimden adım 4.2), tüm miR-181 ailesi (miR-181a, miR-181b, miR – 181c ve miR – 181d) ifade orta pEGFP-şifreli-ifade H9c2 hücreleri göre azalma. MiR-181-sünger hizmet veren tüm miR-181 Aile, rekabetçi bir inhibitörü olarak düşündüğümüz bu yüzden ifade miR – 181 c mitokondrial gen hedef, mt-COX1, artırmak. Western blot verileri mt-COX1 ifade pEGFP kapış ifade H9c2 hücrelere kıyasla pEGFP-miR-181-sünger…

Discussion

Bu makalede açıklanan tasarım ve sentez miRNA-sünger ve nasıl sünger doku özgü ifade doku özgü miRNA aile ifade etkisizleştirmek için güçlü bir araçtır gösterdi.

Sünger hedefleme miR-181 aile bir ifade plazmid ile bir kalp özgü organizatörü klonlanmış göstermiştir. Plazmid verimli bir şekilde nanovector parçacık’dır içine paketlenmiş vitro ve in vivo (Şekil 1) Elektroporasyon veya kuyruk ven enjeksiyon sırasıyl…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Anthony K. L. Leung Bölümü Biyokimya ve moleküler biyoloji teşekkür ediyoruz, Bloomberg Halk Sağlığı Okulu, Johns Hopkins Üniversitesi onun teknik için miR-181-sünger yapı tasarlama konusunda yardım et. Biz de Polina Sysa-Şah ve Kathleen Gabrielson moleküler bölümü ve karşılaştırmalı Pathobiology, miRNA-sünger teslimat Johns Hopkins Tıp Kurumları yanında vivo içinde düşsel teknik yardım için teşekkür ederiz.

Bu eser NIH HL39752 (Charles Steenbergen için) gelen hibe ve Amerikan Kalp Derneği 14SDG18890049 bir bilim adamı kalkınma hibe (için tolga Das) tarafından desteklenmiştir. Sıçan kardiyo özgü organizatörü cömertçe Jeffery ö Molkentin Cincinnati çocuk hastanesinde tarafından sağlandı.

Materials

pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

In VivoNanovectorMicroRNA SpongeHeart-specificMicroRNA KnockdownEGFR PlasmidCMV PromoterAlpha-myosin Heavy Chain PromoterDNA PurificationBacterial TransformationLigation
check_url/it/57845?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image