基于气相色谱-质谱 (gc-ms) 的新陈代谢的果蝇幼虫样品的制备
Summary
此协议描述如何准备果蝇幼虫进行基于 GC-MS 的 metabolomic 分析。
Abstract
最近在新陈代谢领域的进展已建立了果蝇的果蝇, 作为研究动物代谢的强大遗传模型. 通过将大量的果蝇基因工具与调查大量中间代谢的能力结合起来, 新陈代谢方法可以揭示饮食、基因型、生命史事件和环境线索之间的复杂相互作用。此外, 新陈代谢研究可以发现新的酶机制, 并揭示以前未知的联系之间似乎完全不同的代谢途径。为了便于在果蝇社区中更广泛地使用此技术, 我们在这里提供了一个详细的协议, 描述如何准备用于气相色谱-质谱 (GC-MS) 的果蝇幼虫样品-基于 metabolomic 分析。我们的协议包括幼虫样本采集、代谢物提取、化学衍生和 GC-MS 分析的描述。该协议的成功完成将使用户能够测量小极性代谢物的相对丰度, 包括氨基酸、糖和糖酵解和 TCA 循环所涉及的有机酸。
Introduction
果蝇是一种研究调节中间代谢的分子机制的理想系统. 不仅是大多数代谢通路保存在果蝇和人类之间, 但关键的营养传感器和生长调节剂, 如胰岛素, Tor, 和 c-myc, 也活跃在飞1,2。因此,果蝇可以用来探索人类疾病的代谢基础, 从糖尿病和肥胖到变性和癌症。在这方面,果蝇幼虫的发育提供了一个理想的框架, 其中研究代谢计划称为有氧糖酵解, 或华宝效应。正如许多肿瘤使用有氧糖酵解产生碳水化合物的生物量, 所以做果蝇幼虫激活有氧糖酵解促进发展增长3,4,5。这些幼虫与肿瘤代谢的相似性建立了果蝇作为理解如何调节有氧糖酵解的关键模型体内。
尽管苍蝇已经成为研究新陈代谢的流行模型, 但大多数的果蝇研究依赖于用于测量单个代谢产物3(如海藻糖、甘油三酯或 ATP) 的方法。由于需要一个特定的协议来衡量每个代谢产物, 以化验为基础的研究是劳动密集型的, 昂贵的, 并偏向于那些可以用商业工具来衡量的化合物。这些限制的解决方案已经出现在新陈代谢领域, 它提供了研究果蝇新陈代谢的更有效和无偏见的方法。与基于检测的研究不同, 单 metabolomic 分析可以同时测量数以百计的小分子代谢物, 并全面了解生物体的新陈代谢状况6,7。这种技术大大扩大了果蝇代谢研究的范围, 并代表了这一新兴领域8的未来。
Metabolomic 研究主要采用三技术: (一) 核磁共振 (NMR), (ii.) 液相色谱-质谱 (LC), (iii.) 气相色谱-质谱 (gc-ms)9。每种方法都具有明显的优缺点, 所有这些技术都已用于成功研究果蝇代谢。由于我们实验室进行的研究集中在小的极性代谢物上, 我们主要采用了基于 GC-MS 的方法。GC-MS 为用户提供了许多优点, 包括高重现性, 峰值分辨率, 灵敏度, 以及标准电子撞击 (EI) 光谱库的有效性, 它允许快速识别发现的代谢功能10,11。但是, GC-MS 的样品的制备有点复杂, 需要仔细注意细节。样品必须收集, 洗涤, 称量和冷冻的方式, 迅速止渴代谢反应。此外, 苍蝇胴体对标准均匀化协议有抗药性, 需要一个珠磨来确保最佳的代谢产物萃取。最后, 在检测12之前, 用 GC-MS 分析的样品必须经过化学衍生。虽然以前发布的方法描述了所有这些步骤3、13、14, 但仍然需要一个允许新手用户重现性生成高质量数据的可视化协议。在这里, 我们演示如何准备果蝇幼虫样品的 GC-MS 新陈代谢分析。该协议允许用户重现性测量许多组成中央碳代谢的小极性代谢物。
Protocol
Representative Results
Discussion
新陈代谢提供了一个无与伦比的机会来调查代谢反应, 构成中间代谢。然而, 这种技术的敏感性使数据易受遗传背景、发育线索和各种环境应力的影响, 包括温度、湿度、人口密度和养分供应。因此, 高质量和可重复的新陈代谢分析要求在高度控制的条件下收集样品。虽然一些评论强调这一点3,8,23, 在这里我们提供了一个分步方?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
多亏了印第安纳大学的大众光谱学设施和犹他大学新陈代谢的核心设施来帮助优化这个协议。J.M.T. 由国立卫生研究院国立医学研究所 R35GM119557 奖编号支持。
Materials
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
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