Questo protocollo descrive come preparare larve di Drosophila per analisi metabolomica basati su GC-MS.
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Articolo metodologico
Preparazione di campioni larvale della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del Gas (GC-MS)-base di metabolomica
In questo articolo
Sommario
Abstract
I recenti progressi nel campo della metabolomica hanno stabilito il moscerino della frutta Drosophila melanogaster come un potente modello genetico per studiare il metabolismo degli animali. Combinando la vasta gamma di strumenti genetici della drosofila con la capacità di indagine vaste aree del metabolismo intermedio, un approccio di metabolomica può rivelare interazioni complesse tra dieta, genotipo, eventi di vita-storia e stimoli ambientali. Inoltre, studi di metabolomica possono scoprire nuovi meccanismi enzimatici e scoprire connessioni precedentemente sconosciute tra vie metaboliche apparentemente disparate. Al fine di facilitare l'uso più diffuso di questa tecnologia tra la comunità di Drosophila , qui forniamo un protocollo dettagliato che descrive come preparare campioni larvali della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS)- Basato su analisi metabolomica. Il nostro protocollo include descrizioni di campionario larvale, metabolita estrazione, derivatizzazione chimica e analisi GC-MS. Completamento del presente protocollo consentirà agli utenti di misurare l'abbondanza relativa di piccoli metaboliti polari, tra cui amminoacidi, zuccheri e acidi organici coinvolti nella glicolisi e i cicli TCA.
Introduzione
Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è emerso come un sistema ideale per studiare i meccanismi molecolari che regolano il metabolismo intermedio. Non solo sono la maggior parte delle vie metaboliche conservate tra Drosophila e gli esseri umani, ma nutrienti chiave sensori e regolatori di crescita, come l'insulina, Tor e myc, sono anche attivi in volare1,2. Di conseguenza, Drosophila consente di esplorare la base metabolica delle malattie umane che vanno dal diabete e obesità a neurodegenerazione e cancro. A questo proposito, lo sviluppo larvale della drosofila forn....
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Protocollo
1. uovo collezione
- Raccogliere adulti maschi e femmine vergini dei genotipi desiderati. Individualmente l'età questi animali in un flaconcino di cibo con supporti standard di Bloomington per 3 – 5 giorni.
- Impostare gli accoppiamenti appropriati trasferendo 50 femmine vergini e 25 maschi ad un nuovo flacone di cibo.
Nota: Un minimo di sei accoppiamenti indipendenti dovrebbe essere impostato per ciascun genotipo. Un solo campione sarà raccolti da ogni accoppiamento (cioè, sei campioni raccolti da sei accoppiamenti indipendenti). -
Preparare i tappi di deposizione delle uova di melassa.
- Mescolare 115 mL di melass....
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Risultati
Lattato deidrogenasi (dLDH) mutanti, che mancano di dLDH attività4e geneticamente-hanno abbinato i comandi sono stati raccolti come larve di metà-L2 e trattati secondo il protocollo descritto in precedenza. Rispetto ai controlli, larve mutanti mostrano cambiamenti significativi in lattato, piruvato e L-2-idrossiglutarato4. Gli spettri sono stati acquisiti con un sistema di Agilent GC6890-5973i MS. Generare un esempio degli spettri G.......
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Discussione
Metabolomica fornisce un'opportunità senza precedenti per sorvegliare le reazioni metaboliche che compongono il metabolismo intermedio. La sensibilità di questa tecnologia, tuttavia, rende i dati suscettibili di background genetico, stecche inerente allo sviluppo e una varietà di stress ambientali, tra cui temperatura, umidità, densità della popolazione e disponibilità di nutrienti. Di conseguenza, un'alta qualità e riproducibili metabolomica analisi richiedono che i campioni raccolti in condizioni altamente controllate........
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Grazie ai membri dell'impianto di spettroscopia massa di Indiana University e la University of Utah metabolomica Core Facility per assistenza nell'ottimizzazione di questo protocollo. J.M.T. è supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numero R35GM119557.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Melassa nera non solforata | Buon cibo, INC | ||
| Drosophila Agar Tipo II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Piridina | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Metossiammina idrocoloride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA con 1% di trimetilclorosilano | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann' s Lievito secco attivo | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| Flacone da 6 once di drosophila | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Miscela omogeneizzante per tessuti molli (provette da 2 mL) | SKU Omni International | :19-627 | |
| Inserto per fiale, 250 &; L vetro disattivato con piedini in polimero | Agilent | 5181-8872 | |
| Acido succinico-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| acido o-fosforico | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Acido propionico | Sigma | P5561 | |
| p-Idrossi benzoico estere metilico | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| Agitatore MultiTherm con blocco da 24 x 12 mm | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Metanolo | Sigma | 34860 | |
| Provetta da centrifuga da 1,5 mL | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon Piatto per coltura tissutale da 35 x 10 mm | Corning Incorporated | GC 353001 | |
| Phenomex | ZB-5MSi |
Riferimenti
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C.
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Ristampe e permessi
