Beredning av Drosophila Larval prover för gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)-baserad metabolomik
Summary
Det här protokollet beskriver hur du förbereder Drosophila larver för GC-MS-baserade metabolomiska analys.
Abstract
Senaste framstegen inom metabolomik har etablerat bananflugan Drosophila melanogaster som en kraftfull genetisk modell för att studera djurens ämnesomsättning. Genom att kombinera det stora utbud av Drosophila genetiska verktyg med förmåga att kartlägga stora strängar av intermediär ämnesomsättning, kan en metabolomik strategi avslöja komplexa interaktioner mellan kost, genotyp, livshistoria händelser och miljömässiga ledtrådar. Dessutom kan metabolomik studier upptäcka nya enzymatiska mekanismer och avslöja tidigare okända anslutningar mellan till synes disparata metaboliska vägar. För att underlätta mer utbredda användningen av denna teknik bland gemenskapens Drosophila , här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som beskriver hur du förbereder Drosophila larval prover för gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)- baserat metabolomiska analys. Våra protokoll innehåller beskrivningar av larval provsamling, metabolit utvinning, kemiska derivatisering och GC-MS analys. Framgångsrika slutförandet av detta protokoll kommer att tillåta användare att mäta det relativa överflödet av små polära metaboliter, inklusive aminosyror, sockerarter och organiska syror inblandade i glykolys och TCA cykler.
Introduction
Bananflugan Drosophila melanogaster har vuxit fram som ett idealiskt system för att studera den molekylära mekanismen som reglerar intermediär ämnesomsättning. Inte bara bevaras de flesta metaboliska vägar mellan Drosophila och människor, men viktiga näringsämnen sensorer och tillväxtreglerande, såsom insulin, Tor och myc, är också aktiva i flyga1,2. Drosophila kan därför användas för att utforska metabola grunden för mänskliga sjukdomar allt från diabetes och fetma till neurodegeneration och cancer. I detta avseende ger Drosophila larval utveckling den idealiska ramen att studera en metabolisk program som kallas aerob glykolys eller Warburg effekt. Precis som många tumörer använder aerob glykolys generera biomassa från kolhydrater, så aktivera gör Drosophila larver aerob glykolys för att främja utvecklingsmässiga tillväxt3,4,5. Dessa likheter mellan larver och tumör metabolism etablera Drosophila som en viktig modell för att förstå hur aerob glykolys är reglerade i vivo.
Trots det faktum att flugan har vuxit fram som en populär modell för att studera metabolism, de flesta Drosophila studier förlitar sig på metoder som är avsedda att mäta enskilda metaboliter3, såsom trehalos, triglycerider eller ATP. Eftersom ett visst protokoll krävs för att mäta varje metabolit, är assay-baserade studier arbetsintensiva, dyra och partisk mot dessa föreningar som kan mätas med kommersiella kit. En lösning på dessa begränsningar har framkommit inom metabolomik, vilket ger ett mer effektivt och opartiskt sätt att studera Drosophila metabolism. Till skillnad från en test-baserad studie, kan en enda metabolomiska analys samtidigt mäta hundratals småmolekylära metaboliter och tillhandahålla en omfattande förståelse av en organisms metaboliska status6,7. Denna teknik har avsevärt utökat tillämpningsområde Drosophila metabola studier och representerar framtiden för denna framväxande fält8.
Metabolomiska studier utförs främst med tre tekniker: a kärnmagnetisk resonans (NMR), (ii) flytande kromatografi-masspektrometri (LC-MS) och (iii) gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)9. Varje strategi erbjuder tydliga fördelar och nackdelar, och alla dessa tekniker har använts framgångsrikt studera Drosophila metabolism. Eftersom den forskning som bedrivs i vårt labb är inriktad på små, polära metaboliter, anställer vi främst en GC-MS-baserad metod. GC-MS ger användaren ett antal fördelar, inklusive hög reproducerbarhet, peak upplösning, känslighet, och tillgången till en standard elektron inverkan (EI) spektrala bibliotek, vilket möjliggör snabb identifiering av upptäckte metabola funktioner10,11. Beredning av prover för GC-MS, men är ganska komplicerat och kräver en noggrann uppmärksamhet på Detaljer. Prover måste samlas in, tvättas, vägde, och frysta på ett sätt som snabbt släcker metaboliska reaktioner. Dessutom flyga kadavret är resistent mot standard homogenisering protokoll och kräver en pärla kvarn att säkerställa optimal metabolit extraktion. Slutligen måste prover analyseras av GC-MS genomgå kemiska derivatisering före identifiering12. Medan tidigare publicerade metoder beskriva alla dessa steg3,13,14, krävs fortfarande en visuell protokoll som skulle tillåta nybörjarens reproducibly generera data av hög kvalitet. Här visar vi hur att förbereda Drosophila larval prover för GC-MS-baserad metabolomik analys. Detta protokoll tillåter användaren att reproducibly mäta många av de små polära metaboliter som komponera centrala kol metabolism.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metabolomik ger en oöverträffad möjlighet att kartlägga de metaboliska reaktioner som komponerar intermediär ämnesomsättning. Känsligheten hos denna teknik, återger dock data mottagliga för genetisk bakgrund, utvecklingsmässiga ledtrådar och en mängd olika miljöpåfrestningar, inklusive temperatur, luftfuktighet, befolkningstäthet och näringsämnen tillgänglighet. Därför en hög kvalitet och reproducerbara metabolomik analysen kräver att prover tas under mycket kontrollerade förhållanden. Medan fler…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tack vare medlemmarna i Indiana University massa spektroskopi anläggningen och University of Utah metabolomik Core Facility för hjälp med att optimera detta protokoll. J.M.T. stöds av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health under Award nummer R35GM119557.
Materials
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
Riferimenti
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics’: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetica. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C., Metz, T. O. . Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. , 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. . Drosophila: A Laboratory Manual. , 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Biologia dello sviluppo. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
