Funzionalità beta-cellula è importante per l’omeostasi del glucosio nel sangue, che viene valutato a cella singola risoluzione utilizzando un reporter codificato geneticamente per afflusso del calcio.
Beta-cellule pancreatiche rispondono all’aumento delle concentrazioni di glucosio nel sangue che secerne l’ormone insulina. La disfunzione delle cellule beta porta a iperglicemia e conseguenze gravi, pericolo di vita. Comprendere come le beta-cellule operano in condizioni fisiologiche e quali fattori genetici ed ambientali potrebbero causare loro disfunzione potrebbe portare a migliori opzioni di trattamento per i pazienti diabetici. La capacità di misurare i livelli del calcio in cellule beta serve come un importante indicatore della funzione beta-cellulare, come l’afflusso di calcio ioni Trigger rilascio di insulina. Qui descriviamo un protocollo per il monitoraggio l’afflusso di calcio glucosio-stimolata in zebrafish beta-cellule utilizzando GCaMP6s, un sensore codificato geneticamente di calcio. Il metodo consente di monitorare le dinamiche del calcio intracellulare con risoluzione di singole cellule in isolotti ex vivo montato. La glucosio-risposta delle cellule beta entro l’isolotto stesso possa essere catturata contemporaneamente sotto le concentrazioni di glucosio differenti, che suggerisce la presenza di eterogeneità funzionale tra zebrafish beta-cellule. Inoltre, la tecnica fornisce alta risoluzione temporale e spaziale, che rivela la natura oscillatoria dell’afflusso del calcio su stimolo del glucosio. Il nostro approccio apre le porte per utilizzare zebrafish come modello per studiare il contributo di fattori genetici ed ambientali alla funzione beta-cellulare e disfunzione.
La nostra glicemia è mantenuta in un intervallo ristretto, in gran parte dovuto la funzione del pancreas endocrino. Il ruolo endocrino del pancreas è eseguito da degli isolotti di Langerhans, che contengono cellule disecrezione. Il beta-cellule secernenti insulina sono responsabili della riduzione dei livelli di glucosio nel sangue dopo un pasto contenente carboidrati. Secrezione di insulina insufficiente da beta-cellula può causare diabete1, che è caratterizzato da glicemia alta sostenuta. Tipo 1 e diabete di tipo 2, che attualmente affligge più di 400 milioni di persone nel mondo, conduce alla morbosità ed alla mortalità2. Indagando i fattori molecolari e ambientali che contribuiscono alla disfunzione beta-cellulare, comprenderemo meglio come diabete di tipo 2 inizia e progredisce. Inoltre, la capacità di differenziare cellule staminali umane in beta-cellule funzionali in vitro può fornire una fonte di nuove cellule beta per le terapie di sostituzione cellulare nel diabete di tipo 1. A tal fine, è importante studiare la funzione beta-cellulare e la maturazione in organismi modello genetico al fine di acquisire le conoscenze necessarie per rendere funzionale beta-cellule in un piatto.
Funzionalità delle cellule beta può essere monitorato a livello di intero-isolotto di quantificare la quantità totale di insulina secernuta in risposta a stimolazione del glucosio. Questo approccio cumulativo studia l’isolotto come un singolo gruppo di cellule senza differenziare le singole proprietà di una cella. Tuttavia, l’analisi delle risposte del glucosio delle cellule beta individuali ha rivelato una diversità nelle proprietà funzionali delle cellule beta e la presenza di eterogeneità3. Per valutare la funzione delle beta-cellule individuali, è possibile monitorare i cambiamenti intracellulari che portano alla secrezione di insulina4. La secrezione dell’insulina è preceduta da un’entrata del glucosio nelle cellule beta. Il glucosio che entra nelle cellule beta viene rapidamente metabolizzato all’ATP. Più alte concentrazioni di ATP intracellulare diminuiscono la probabilità aperta di canali di ioni del potassio ATP-sensibili che portano alla depolarizzazione della cellula beta. Depolarizzazione apre i canali ionici voltaggio-dipendenti del calcio e aumenta il calcio intracellulare. A sua volta, calcio innesca l’esocitosi di insulina, che viene rilasciato nella circolazione e abbassa i livelli di glucosio promuovendo l’utilizzazione del glucosio5,6,7.
Diverse strategie sono state applicate per studiare la funzione delle cellule beta, tra cui monitoraggio del potenziale di membrana8, visualizzazione diretta di insulina-vescicole esocitosi9e la quantificazione di intracellulare di Ca2 + afflusso come proxy per glucosio-reattività10. Fra loro, la formazione immagine del intracellulare di Ca2 + offre il vantaggio di upscaling l’analisi a più celle individuali all’interno stesso dell’isolotto11,12, consentendo per un confronto diretto della glucosio-responsività tra beta-cellule individuali. Concentrazione intracellulare di Ca2 + possa essere monitorata utilizzando coloranti fluorescenti sensibili al calcio13 o geneticamente codificato calcio indicatori (GECIs)14. Considerando che il calcio-indicatore coloranti mancanza cellula-tipo specificità, GECIs può essere espressa in uno specifico tipo cellulare di promotori specifici. Inoltre, la nuova generazione di GECIs, come GCaMP6, fornisce il migliore rapporto segnale-rumore insieme più veloce dinamica temporale15. Qui descriviamo l’utilità della nuovo-generazione di GECIs, in particolare GCaMP6s, visualizzare calcio in cellule beta a cella singola risoluzione. Applichiamo questo metodo fino all’isolotto di zebrafish primario come il nostro modello di scelta. Durante lo sviluppo embrionale, beta-cellule nell’isolotto primaria provengono da dorsale e ventrale del pancreas boccioli16. L’isolotto primario si trova in una posizione anatomica stereotipata all’interno del pancreas di zebrafish, consentendo la facile identificazione e isolamento. Beta-cellule nell’isolotto primaria sono necessari per la regolazione del glucosio, come loro ablazione genetica conduce a iperglicemia17,18. Inoltre, queste cellule beta diventano glucosio-reattiva durante i primi zebrafish sviluppo19. Questo protocollo può essere applicato anche per gli isolotti secondari, che si formano durante le fasi di post-embrionale di imaging. Il protocollo permette di immagine beta-cellule ex vivo, alle successive fasi di sviluppo e sotto le concentrazioni di glucosio definiti.
Qui dimostriamo una tecnica per la quantificazione-risposta delle cellule beta glucosio a cella singola risoluzione. Ciò è reso possibile da monitorare la concentrazione di calcio intracellulare utilizzando un indicatore di calcio geneticamente codificati, GCaMP6s. L’attività della beta-cellula è acquisito ex vivo montando l’isolotto in uno stampo di fibrinogeno-trombina. Un passaggio fondamentale del protocollo è la stabilità dello stampo. Tempo sufficiente deve essere dato per il fibrinogeno sciogliere nella soluzione di HBSS. Senza questo, la muffa non polimerizza sufficientemente per fornire la stabilità durante la sessione di imaging. Un isolotto montato in stampo di fibrinogeno-trombina e immersi in terreni di coltura delle cellule possa rimanere vitale per almeno una settimana (dati non mostrati). Alternative allo stampo di fibrinogeno-trombina, come dell’agarosi di basso-fusione, possono essere utilizzate per montare l’ isolotto22. Un altro parametro critico è la dissezione dell’isolotto. Durante questo passaggio, il tessuto che circonda l’isolotto deve essere rimosso senza ferire o frugando l’isolotto. Una dissezione abile è dotato di pratica.
Una limitazione del protocollo imaging è la limitazione a un piano confocale dell’isolotto. Questo viene fatto per catturare le dinamiche di afflusso del calcio all’interno di singole cellule beta. Uno Z-stack attraverso l’intero spessore dell’isolotto conduce a bassa velocità e perdita di segnale oscillatorio da singole celle imaging. Questa limitazione potrebbe essere migliorata utilizzando mezzi più veloci di imaging confocale come microscopia di disco rotante, per consentire di catturare le dinamiche del calcio in 3 dimensioni. Un’altra frontiera sarebbe in vivo del calcio imaging12. La natura trasparente di embrione di pesce zebra o l’uso di ceppi di pigmento-meno di zebrafish adulti23 potrebbe aprire la possibilità per in vivo imaging in futuro.
L’imaging di attività della beta-cellula ad alta risoluzione spaziale e temporale consente di indagare l’eterogeneità funzionale tra beta-cellule individuali. Questo approccio può aiutare a far luce sull’esistenza di sub-popolazioni beta-cellula. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato l’esistenza delle sottopopolazioni nelle dimensioni nominali omogenee beta-cellule24,25,26. Ex vivo imaging può essere combinato con reporter genetici per la caratterizzazione della risposta della sub-popolazione a glucosio. Inoltre, combinando il programma di installazione di imaging con stimolo farmacologico può consentire per screening di composti che potrebbero migliorare la funzionalità delle cellule beta.
In sintesi, la tecnica presentata qui permette la quantificazione e confronto tra la velocità di risposta del glucosio per beta-cellule individuali. Fornisce una finestra diretta nella funzionalità delle cellule beta, un parametro importante nello sviluppo del diabete.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i membri del laboratorio Ninov per commenti sul manoscritto, membri del centro per strutture di pesce e microscopia di Dresda di terapie rigenerative (CRTD) per assistenza tecnica. N.N. è sostenuto da finanziamenti da DFG-CRTD, Cluster of Excellence di TU-Dresden, Fondazione di ricerca tedesca (DFG) e il centro tedesco per la ricerca di diabete (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |