In Situ Hybridisatie technieken voor paraffine-ingebedde volwassen koraal monsters
Summary
Het doel van dit protocol is voor het uitvoeren van in situ hybridisatie op volwassen koraal monsters die zijn ingesloten in paraffine en gesegmenteerd in glas dia’s. Dit is een kwalitatieve methode gebruikt voor het visualiseren van de ruimtelijke uitdrukking van een sonde van de anti-zin RNA in paraffine-ingebedde weefsels.
Abstract
Koralen zijn belangrijke Oceaan-ongewervelde dieren die kritisch zijn voor de algehele gezondheid van de Oceaan, alsmede de gezondheid van de mens. Echter, als gevolg van menselijke invloed zoals stijgende oceaan temperaturen en de verzuring van de Oceaan, koralen zijn steeds meer bedreigd. Om deze uitdagingen aan te pakken, vooruitgang in de cel- en moleculaire biologie gebleken doorslaggevend zijn voor de diagnose van de gezondheid van koralen. Wijzigen van aantal van de technieken die vaak gebruikt in de menselijke geneeskunde, kan onderzoekers kunnen behandelen en opslaan van koralen aanzienlijk verbeteren. Om aan te pakken dit, is een protocol voor in situ hybridisatie hoofdzakelijk gebruikt in de menselijke geneeskunde en evolutionaire ontwikkelingsbiologie aangepast voor gebruik in volwassen koralen onder stress.
Het doel van deze methode is om te visualiseren de ruimtelijke uitdrukking van een RNA-sonde in volwassen koraal weefsel dat is ingesloten in paraffine en gesegmenteerd in glas dia’s. Deze methode richt zich op de verwijdering van paraffine en rehydratie van het monster, voorbehandeling van het monster te waarborgen van de permeabiliteit van de steekproef, de kruising van de pre-incubatie, kruising van de RNA-sonde en visualisatie van de RNA-sonde. Dit is een krachtige methode bij het gebruik van niet-modelorganismen om te ontdekken waar specifieke genen worden uitgedrukt, en het protocol kan gemakkelijk aangepast voor andere niet-model-organismen. De methode is echter beperkt, in die zin dat het vooral kwalitatieve, omdat de expressie intensiteit kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid tijd gebruikt tijdens de stap van visualisatie en de concentratie van de sonde. Geduld is bovendien vereist, als dit protocol kan nemen tot 5 dagen (en in veel gevallen, langere) afhankelijk van de sonde wordt gebruikt. Tot slot, niet-specifieke achtergrondkleuring is gemeenschappelijk, maar deze beperking kan worden overwonnen.
Introduction
Koralen zijn kritische ecosysteem bouwers en belangrijk is voor de biodiversiteit in de Oceaan en de gezondheid van de mens1,2,3. Ze worden bedreigd als gevolg van de klimaatverandering en andere antropogene stressoren en vele soorten koraal worden beschouwd als kritisch bedreigde. Er is dus behoefte aan een belangrijke cellulaire en moleculaire tools voor de diagnose van koralen onder stress. Ook, er is weinig begrepen over waar de genen binnen volwassen koraal weefsel, en dus weinig begrip van de functies van deze genen worden uitgedrukt. Om dit probleem te verhelpen, hebben we het in situ hybridisatie (ISH) protocol, vaak gebruikt in de menselijke geneeskunde en evolutionaire ontwikkelingsbiologie, voor gebruik op paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van volwassen koralen aangepast. Deze techniek is het meest krachtige wanneer gebruikt op volwassen koralen die een stressvolle gebeurtenis zoals blootstelling aan hittestress hebben ondergaan. Echter, deze techniek kan worden gebruikt op een breed scala van weefsels en levensfasen in koralen en is niet beperkt tot alleen warmte-benadrukt koralen4,6,7. Deze techniek kan bovendien worden gebruikt op weefsels of cellen van een metazoan, zolang er cDNA opeenvolgingsinformatie beschikbaar is.
Het doel van deze methode is om te visualiseren van RNA sondes binnen volwassen koraal weefsel dat is bewaard gebleven en ingebed in paraffine en gesegmenteerd in dia’s. Deze methode is een krachtig diagnostisch hulpprogramma waarmee voor de visualisatie van nucleïnezuren binnen volwassen koraal weefsel. In eerste instantie deze methode werd ontwikkeld voor medische diagnostiek, en het is sindsdien een populaire tool op gebieden zoals ontwikkelingsbiologie en evolutionaire ontwikkelingsbiologie8,9,10. ISH is ook een kritische methode, met name in de niet-modelsystemen, wanneer genomic en transcriptomic sequencedata zijn beschikbaar maar ruimtelijke gen expressiepatronen zijn onbekend. Voor diagnostische werk in niet-modelsystemen is deze techniek krachtig omdat het aangeven kunt welke cellen en weefsels express een gen van belang en tot meer gerichte therapeutische benaderingen8,9,10leiden kunnen, 11,12. Tot slot, deze techniek is kwalitatieve en krachtiger wanneer in paren gerangschikt met kwantitatieve gen expressie gegevens11.
De in dit document geschetste benadering zal van belang zijn voor onderzoekers die reeds een heksenkruid (DIG) ontworpen-label RNA sonde (zowel de betekenis en antisense sondes) en zijn nu klaar om uit te voeren in situ hybridisatie van de sondes op een steekproef. Voor het uitvoeren van deze methode, zal twee seriële secties van een paraffine koraal weefsel nodig zijn voor elke sonde wordt getest. Één sectie zal worden gebruikt voor de zin sonde en de andere voor de antisense sonde. De sonde zin zullen een besturingselement aan niet-specifieke binding. Als de kleuring wordt waargenomen in de sonde zin, vervolgens is de antisense sonde niet specifiek voor het RNA van belang. Sondes kunnen worden ontworpen voor elk gen uitgedrukt. In dit protocol, verschillende voorbeelden worden gebruikt die eerder werden gevonden tijdens hittestress in koralen worden uitgedrukt: FBJ lymfkliertest Osteosarcoom virale oncogen homolog B (Fos-B), Activator eiwit (AP1), en Tumor necrose factor receptor (TNFR 41) – 4111. ISH met behulp van de DIG-geëtiketteerden RNA sondes heeft de voorkeur boven het gebruik van radioactieve sondes, omdat de behandeling veel veiliger10 is. Bovendien, deze techniek is zeer gevoelig en kan worden uitgevoerd op een breed scala van weefsels en de embryo’s dan warmte-benadrukt volwassen koralen13,14,15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit protocol beschreven methode is gewijzigd van eerdere werkzaamheden in medisch en evolutionaire developmental onderzoek8,9,10,12,17. Dit protocol is gericht op de nuances van een in situ -hybridisatie met een DIG-geëtiketteerden RNA anti-zin-sonde op volwassen koralen, die zijn bewaard en ingebed in paraffine. Deze methode kan gemakkelijk wo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door award geen. OCE-1323652 door de National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship en award no.1012629 vanuit de Burroughs Wellcome Fonds postdoctorale verrijking programma.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
Riferimenti
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
