In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine
Summary
L’objectif de ce protocole consiste à effectuer l’hybridation in situ sur des échantillons de corail adultes qui ont été incorporés à la paraffine et sectionnés sur lames de verre. Il s’agit d’une méthode qualitative permettant de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN anti-sens dans les tissus inclus en paraffine.
Abstract
Les coraux sont des invertébrés océan important qui sont essentiels pour la santé globale de l’océan, mais aussi la santé humaine. Toutefois, en raison des impacts anthropiques tels que la hausse des températures de l’océan et l’acidification des Océans, les coraux sont plus en plus sous la menace. Pour relever ces défis, les progrès en biologie cellulaire et moléculaire ont prouvé très importante pour le diagnostic de la santé des coraux. Modifiant certaines des techniques couramment utilisés en médecine humaine pourrait améliorer considérablement la capacité des chercheurs pour traiter et sauver les coraux. Pour y remédier, un protocole pour l’hybridation in situ , utilisé principalement pour la médecine humaine et biologie évolutive du développement a été adapté pour une utilisation chez les adultes coraux sous contrainte.
Le but de cette méthode est de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN dans le tissu corail adulte qui a été incorporé à la paraffine et sectionné sur lames de verre. Cette méthode met l’accent sur l’élimination de la paraffine et la réhydratation de l’échantillon, le prétraitement de l’échantillon afin d’assurer la perméabilité de l’échantillon, hybridation pré incubation, hybridation de la sonde d’ARN et la visualisation de la sonde d’ARN. Il s’agit d’une méthode puissante lors de l’utilisation des organismes non-modèles à découvrir où certains gènes sont exprimés, et le protocole peut être facilement adapté pour d’autres organismes non-modèle. Toutefois, la méthode est limitée car il s’agit avant tout qualitative, parce que l’intensité de l’expression peut varier selon la quantité de temps utilisé lors de l’étape de visualisation et de la concentration de la sonde. En outre, la patience est nécessaire, comme ce protocole peut prendre jusqu’à 5 jours (et dans bien des cas, plus longtemps), selon la sonde utilisée. Enfin, la coloration de fond non spécifique est commune, mais cette limitation peut être surmontée.
Introduction
Les coraux sont des bâtisseurs de l’écosystème critique et important pour la biodiversité dans l’océan et la santé humaine1,2,3. Ils sont menacés en raison des changements climatiques et autres facteurs de stress anthropiques, et nombreuses espèces de coraux sont considérés comme en danger critique d’extinction. Ainsi, il y a un besoin important pour des outils moléculaires et cellulaires diagnostiquer les coraux sous contrainte. En outre, il est peu compris sur où sont expriment des gènes dans le tissu corail adulte et donc peu de compréhension des fonctions de ces gènes. Pour résoudre ce problème, nous avons adapté le protocole de hybridation (ISH) in situ , couramment utilisé en médecine humaine et biologie évolutive du développement, pour une utilisation sur des échantillons de tissus inclus en paraffine de coraux adultes. Cette technique est plus performant lorsqu’il est utilisé sur des coraux adultes ayant subi un événement stressant, comme l’exposition au stress thermique. Cependant, cette technique peut être utilisée sur une large gamme de tissus et les étapes de la vie chez les coraux et n’est pas limitée à la seule chaleur coraux4,6,7. En outre, cette technique peut servir sur des tissus ou des cellules de n’importe quel métazoaires tant que les informations de séquence d’ADNc est disponible.
Le but de cette méthode consiste à visualiser les sondes d’ARN au sein du tissu corail adulte qui a été préservé et incorporé à la paraffine et sectionné sur glissières. Cette méthode est un outil de diagnostic puissant qui permet la visualisation des acides nucléiques dans le tissu corail adult. Initialement, cette méthode a été développée pour le diagnostic médical, et c’est désormais un outil populaire dans des domaines comme la biologie du développement et de la biologie évolutive du développement8,9,10. ISH est également une méthode critique, particulièrement dans les systèmes non-modèle, lorsque génomique et transcriptomique séquence des données sont disponibles, mais profils d’expression génique spatiale sont inconnus. Pour le travail de diagnostic dans les systèmes non-modèle, cette technique est puissante car il peut indiquer quelles cellules et des tissus exprimant un gène d’intérêt et peuvent conduire à plusieurs approches thérapeutiques ciblées8,9,10, 11,12. Enfin, cette technique est qualitative et plus puissant lorsqu’il est associé avec quantitative gene expression données11.
L’approche décrite dans cet article seront d’intérêt pour les chercheurs qui ont déjà conçu un digoxigénine (DIG)-étiqueté sonde d’ARN (les sens et antisens sondes) et sont maintenant prêts à effectuer l’hybridation in situ des sondes à un échantillon. Pour exécuter cette méthode, deux coupes sériées d’un tissu de paraffine corail seront nécessaire pour chaque sonde mis à l’essai. Une section servira pour la sonde de sens et l’autre pour la sonde antisense. La sonde de sens sera un contrôle pour indiquer les liaisons non spécifiques. Si la coloration est observée au niveau de la sonde de sens, puis la sonde antisense n’est pas spécifique à l’ARN d’intérêt. Sondes peuvent être conçus pour n’importe quel gène exprimé. Dans ce protocole, plusieurs exemples sont utilisés qui ont été précédemment trouvés à s’exprimer au cours d’un stress thermique chez les coraux : FBJ ostéosarcome murine homologue viral oncogene B (Fos-B), protéine activatrice (AP1) et le Tumor necrosis factor receptor 41 (41 TNFR)11. ISH, à l’aide de sondes d’ARN creuser-étiquetée est préférable à l’aide de sondes radioactives, parce que leur manipulation est beaucoup plus sûr10. En outre, cette technique est très sensible et peut être réalisée sur une large gamme de tissus et d’embryons au-delà de chaleur des coraux adultes13,14,15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite dans le présent protocole a été modifiée à partir de travaux antérieurs dans la recherche médicale et évolutive du développement8,9,10,12,17. Ce protocole met l’accent sur les nuances d’une hybridation in situ avec une sonde d’anti-sens RNA creuser-étiquetés sur les coraux adultes, qui ont été préservés et int…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par indemnité aucune. OCE-1323652 par le biais de la National Science Foundation Ocean Science bourse postdoctorale et prix no.1012629 provenant du programme d’enrichissement postdoctorales Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
Riferimenti
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