In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è effettuare ibridazione in situ su adulti coralli campioni che sono stati inclusi in paraffina e sezionati su vetrini. Si tratta di un metodo qualitativo permette di visualizzare l’espressione spaziale di una sonda di RNA anti-senso in tessuti paraffina-incastonati.
Abstract
I coralli sono invertebrati oceano importanti che sono critici per la salute generale dell’oceano così come la salute umana. Tuttavia, a causa di impatti antropici come aumento delle temperature dell’oceano e l’acidificazione degli oceani, coralli sono sempre più minacciati. Per affrontare queste sfide, i progressi nella biologia cellulare e molecolare hanno dimostrato di essere fondamentale per la diagnosi della salute dei coralli. Modificare alcune delle tecniche comunemente utilizzate in medicina umana potrebbe migliorare notevolmente la capacità dei ricercatori di trattare e salvare i coralli. Per risolvere questo problema, un protocollo per l’ibridazione in situ utilizzato principalmente in medicina umana e biologia inerente allo sviluppo evolutiva è stato adattato per l’uso in adulti Coralli sotto stress.
Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare l’espressione spaziale di una sonda RNA in tessuto adulto corallo che è stato incastonato in paraffina e sezionato su vetrini. Questo metodo si concentra sulla rimozione della paraffina e reidratazione del campione, il pretrattamento del campione per garantire permeabilità del campione, pre-l’ibridazione incubazione, ibridazione della sonda RNA e la visualizzazione della sonda RNA. Si tratta di un metodo potente quando si utilizza organismi non-modello per scoprire dove sono espressi geni specifici, e il protocollo può essere facilmente adattato per altri organismi non-modello. Tuttavia, il metodo è limitato in quanto è soprattutto qualitativa, perché espressione intensità può variare a seconda della quantità di tempo utilizzata durante il punto di visualizzazione e la concentrazione della sonda. Inoltre, pazienza è necessaria, in quanto questo protocollo può richiedere fino a 5 giorni (e in molti casi, più a lungo) a seconda della sonda viene utilizzata. Infine, una colorazione di fondo non specifico è comune, ma questa limitazione può essere superata.
Introduction
Coralli sono costruttori di ecosistema critico e importante per la biodiversità nell’oceano e salute umana1,2,3. Sono minacciata a causa del cambiamento climatico e altri fattori di stress antropogenici, e molte specie di corallo sono considerate in pericolo critico. Così, c’è un forte bisogno di strumenti molecolari e cellulari per diagnosticare Coralli sotto stress. Inoltre, là poco è capito circa dove i geni sono espressi all’interno di tessuto adulto corallo e quindi poca comprensione delle funzioni di questi geni. Per risolvere questo problema, abbiamo adattato il in situ (ISH) protocollo di ibridazione, comunemente utilizzato in medicina umana e biologia evolutiva dello sviluppo, per l’uso su campioni di tessuto paraffina-incastonato di coralli adulti. Questa tecnica è più potente quando viene utilizzato su Coralli adulti che hanno subito un evento stressante come l’esposizione allo stress da calore. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata su una vasta gamma di tessuti e fasi della vita di coralli e non è limitata al solo calore-sollecitato coralli4,6,7. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata su tessuti o cellule di qualsiasi metazoi finché sono disponibili informazioni di sequenza di cDNA.
Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare le sonde del RNA all’interno di tessuto adulto corallo che è stata conservata e inclusi in paraffina e sezionati sui vetrini. Questo metodo è un potente strumento di diagnostica che permette di visualizzare degli acidi nucleici all’interno di tessuto adulto corallo. Inizialmente questo metodo è stato sviluppato per la diagnostica medica, e da allora è diventato uno strumento popolare in campi come la biologia dello sviluppo e biologia inerente allo sviluppo evolutiva8,9,10. ISH è anche un metodo critico, specialmente in sistemi non-modello, quando genomica e trascrittomica dati di sequenza sono disponibili ma pattern di espressione genica spaziale sono sconosciuti. Per lavoro diagnostico in sistemi non-modello, questa tecnica è potente perché può indicare quali cellule e tessuti esprimono un gene di interesse e possono portare a ulteriori approcci terapeutici mirati8,9,10, 11,12. Infine, questa tecnica è più potente quando accoppiato con espressione genica quantitativa dei dati11e qualitativa.
L’approccio descritto in questo articolo sarà di interesse per i ricercatori che hanno già progettato un digossigenina (DIG)-scritta sonda RNA (sonde sia il senso e antisenso) e sono ora pronti per eseguire in situ di ibridazione delle sonde ad un campione. Per eseguire questo metodo, due sezioni di serie di un tessuto paraffina corallo saranno necessari per ogni sonda in fase di test. Una sezione sarà utilizzata per la sonda di senso e l’altra per la sonda antisenso. La sonda di senso sarà un controllo per indicare il legame non specifico. Se si osserva una colorazione della sonda di senso, quindi la sonda antisenso non è specifica per il RNA di interesse. Sonde possono essere progettati per qualsiasi gene espresso. In questo protocollo, alcuni esempi sono utilizzati che precedentemente sono stati trovati per essere espressi durante lo stress da calore in Coralli: omologo FBJ osteosarcoma murino oncogene virale B (Fos-B), proteina dell’attivatore (AP1) e fattore di necrosi tumorale recettore 41 (TNFR 41)11. ISH usando le sonde Scavare-contrassegnate RNA è preferito rispetto all’uso di sonde radioattive perché la loro gestione è molto più sicuro10. Inoltre, questa tecnica è altamente sensibile e può essere eseguita su una vasta gamma di tessuti ed embrioni oltre ha sottolineato calore adulto coralli13,14,15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto in questo protocollo è stato modificato dal lavoro precedente in ricerca inerente allo sviluppo evolutivo medico8,9,10,12,17. Questo protocollo si concentra sulle sfumature di un’ibridazione in situ con una sonda di scavare-contrassegnate RNA anti-senso sui coralli adulti, che sono stati conservati e inclusi in paraffina. Questo m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal premio no. OCE-1323652 attraverso la National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship e il premio no.1012629 dal programma di arricchimento Postdoctoral di Burroughs Wellcome fondo.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
Riferimenti
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