यहां हम डबल-किनारा डीएनए जीनोम के साथ संयंत्र वायरस की पहचान करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं । हम संक्रमित पत्तियों से डीएनए और शाही सेना निकालने और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण बाहर ले जाने के लिए मानक तरीकों का उपयोग करें । Bioinformatic उपकरण contigs में दृश्यों को इकट्ठा, contigs वायरस जीनोम का प्रतिनिधित्व करने और वर्गीकरण समूहों के जीनोम आवंटित की पहचान ।
इस metagenome दृष्टिकोण परिपत्र डीएनए जीनोम और उनके टेप के साथ संयंत्र वायरस की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अक्सर संयंत्र डीएनए वायरस है कि उनके मेजबान में कम titers में होते है या यांत्रिक नहीं किया जा सकता है एक और मेजबान के लिए inoculated को संक्रामक सामग्री का एक बड़ा titer हासिल प्रचार मुश्किल है । संक्रमित पत्तियों इष्टतम पीएच और ईओण संरचना सबसे bacilliform पैरा retroviruses शुद्ध करने के लिए सिफारिश के साथ एक हल्के बफर में जमीन कर रहे हैं । यूरिया को शामिल करने निकायों कि जाल virions तोड़ने और सेलुलर घटकों को भंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विभेदक केंद्रापसारक संयंत्र संदूषणों से virions के आगे जुदाई प्रदान करता है । इसके बाद proteinase K treatment capsids को हटा देता है । तो वायरल डीएनए केंद्रित है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के लिए इस्तेमाल किया । NGS डेटा जो जनरेट किए गए dataset में वायरस अनुक्रम का एक सबसेट की पहचान करने के लिए NCBI-BLASTn करने के लिए सबमिट किया गया contigs को एकत्रित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं । एक समानांतर पाइपलाइन में, आरएनए एक मानक स्तंभ-आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग कर संक्रमित पत्तियों से पृथक है । तो ribosome कमी बाहर किया जाता है mRNA और वायरस टेप के एक सबसेट के लिए समृद्ध । इस डेटासेट में वायरस दृश्यों का एक सबसेट की पहचान करने के लिए NCBI-BLASTn करने के लिए प्रस्तुत किया गया था आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) से व्युत्पंन अनुक्रम इकट्ठा । हमारे अध्ययन में, हम दो डेटासेट में दो संबंधित पूर्ण लंबाई badnavirus जीनोम की पहचान की । इस विधि एक और आम दृष्टिकोण है जो छोटे आरएनए अनुक्रम की कुल जनसंख्या अर्क संयंत्र वायरस जीनोमिक दृश्यों का पुनर्गठन करने के लिए पसंद किया जाता है । यह उत्तरार्द्ध metagenomic पाइपलाइन वायरस से संबंधित दृश्यों कि रेट्रो टाइपिंग तत्वों संयंत्र जीनोम में डाला जाता है ठीक हो । यह जैव रासायनिक या आणविक परख करने के लिए युग्मित करने के लिए आगे सक्रिय रूप से संक्रामक एजेंटों विचार है । इस अध्ययन में प्रलेखित दृष्टिकोण, ठीक हो जाता है कि संभावना सक्रिय वायरस संक्रमण का संकेत वायरस नकल के अनुक्रम प्रतिनिधि ।
उभरते संयंत्र रोग शोधकर्ताओं ड्राइव करने के लिए नए उपकरण विकसित करने के लिए सही कारण एजेंट (ओं) की पहचान । नई या आवर्ती वायरस रोगों की प्रारंभिक रिपोर्ट ऐसी मोज़ेक और पत्ती, नस समाशोधन, बौना, मुरझाना, घावों, परिगलन, या अन्य लक्षणों की विकृतियों के रूप में आमतौर पर होने वाले लक्षणों के आधार पर कर रहे हैं । एक रोग के लिए कारण एजेंट के रूप में एक नए वायरस की रिपोर्टिंग के लिए मानक यह अंय दूषित रोगजनकों से अलग है, यह उपयुक्त मेजबान में प्रचार, और मूल मेजबान प्रजातियों के स्वस्थ पौधों में inoculating द्वारा रोग पुनरुत्पादन । इस दृष्टिकोण में सीमा है कि संयंत्र वायरस के कई पीढ़ी एक उपयुक्त मेजबान या मूल मेजबान प्रजातियों को वापस करने के लिए संचरण के लिए एक कीट या अंय वैक्टर पर निर्भर करते हैं । इस मामले में, उपयुक्त वेक्टर के लिए खोज लंबे समय तक हो सकता है, वहां के लिए सदिश की प्रयोगशाला कालोनियों स्थापित करने के लिए कठिनाइयों हो सकता है, और आगे के प्रयासों के लिए प्रयोगात्मक संचरण के लिए एक प्रोटोकॉल ईजाद करना आवश्यक हैं । यदि सफल प्रयोगशाला संचरण अध्ययन के लिए शर्तों को प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो काम एक नए वायरस रोग की रिपोर्टिंग के लिए मानक से कम हो जाता है । वायरस है कि बहुत कम titers में उनके प्राकृतिक मेजबान में पाए जाते हैं, शोधकर्ताओं के लिए प्रचार के लिए पर्याप्त संक्रामक शेयरों को बनाए रखने के लिए शोध के लिए वैकल्पिक मेजबान की पहचान करनी चाहिए । वायरस प्रजातियों के लिए है कि केवल कुछ पौधों को संक्रमित यह भी शेयर संस्कृतियों1बढ़ के लिए एक बाधा हो सकती है ।
हाल के वर्षों में, वैज्ञानिकों को अधिक बार काम कर रहे है उच्च प्रवाह NGS और metagenomic के दृष्टिकोण को उजागर वायरस अनुक्रम है कि पर्यावरण में मौजूद हैं, जो एक ज्ञात रोग के लिए असंबंधित मौजूद हो सकता है, लेकिन वर्गीकरण प्रजातियों और पीढ़ी को सौंपा जा सकता है 2 , 3 , 4. एक अलग वातावरण में खोज और आनुवंशिक सामग्री के वर्गीकरण के लिए इस तरह के दृष्टिकोण एक निश्चित पारिस्थितिकी तंत्र में प्रकृति या उनकी उपस्थिति में वायरस विविधता का वर्णन करने के लिए एक तरीका है, लेकिन जरूरी परिभाषित करने के लिए एक रूपरेखा के लिए पुष्टि नहीं है प्रदान एक स्पष्ट रोग के लिए कारण एजेंटों ।
Badnavirus जीनस pararetroviruses के परिवार Caulimoviridae के अंतर्गत आता है । ये वायरस लगभग 7 से 9 केबी के परिपत्र डबल कतरा डीएनए जीनोम के साथ आकार में bacilliform हैं । सभी pararetroviruses एक आरएनए मध्यवर्ती के माध्यम से दोहराने । Pararetroviruses episomes के रूप में मौजूद है और संयंत्र गुणसूत्र डीएनए के स्वतंत्र दोहराने5,6। वायरस आबादी के क्षेत्र अध्ययनों से संकेत मिलता है कि इन वायरस आबादी आनुवंशिक रूप से जटिल हैं । इसके अलावा, उच्च प्रवाह अनुक्रमण द्वारा संयंत्र जीनोम की एक सीमा के पार प्राप्त जानकारी badnavirus जीनोम संयंत्र जीनोम में नाजायज एकीकरण की घटनाओं द्वारा डाला टुकड़े के कई उदाहरण खुला है । ये अंतर्जात badnavirus जुगाड़7,8,9,10,11संक्रमण के साथ जरूरी नहीं जुड़े हैं । बाद में, NGS का उपयोग करने के लिए रोग के कारण एजेंट के रूप में नए badnaviruses की पहचान episomal जीनोम के उपजनसंख्या विविधता से जटिल है और साथ ही अंतर्जात अनुक्रम12,13की घटना ।
जबकि वहां उपंयास pararetrovirus जीनोम की खोज के लिए एक इष्टतम पाइपलाइन नहीं है, वहां दो आम दृष्टिकोण रोग के लिए कारण एजेंटों के रूप में इन वायरस की पहचान कर रहे हैं । एक विधि को संक्रमित पत्तियों से छोटे आरएनए दृश्यों के लिए समृद्ध और फिर वायरस जीनोम (ओं) को फिर से गठित करने के लिए इन दृश्यों को इकट्ठा करने के लिए है14,15,16,17. एक अंय दृष्टिकोण रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) को परिपत्र डीएनए वायरस जीनोम18बढ़ाना है । आरसीए की सफलता पत्ती की उंर और चयनित ऊतक में वायरस titer पर निर्भर करता है । आरसीए उत्पादों के लिए पाचन प्रतिबंध के अधीन है और प्रत्यक्ष अनुक्रमण के लिए plasmids में क्लोन19,20,21।
भंग येलो क्लोरोटिक वायरस (CaYMV) एक badnavirus है और भंग में पीली क्लोरोटिक रोग के etiological कारण के रूप में वर्णित है, हालांकि केवल जीनोम का ५६५ बीपी टुकड़ा पहले से संक्रमित cannas22से अलग किया गया है । एक समकालीन अध्ययन Alpinia purpurata में CaYMV की पहचान (फूल अदरक; CaYMV-एपी)23. इस अध्ययन का लक्ष्य संक्रमित भंग लिली से पूरा badnavirus जीनोम दृश्यों को ठीक करने के लिए किया गया था । हम संयंत्र संदूषणों से वायरस शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और फिर इस तैयारी से वायरल डीएनए अलग है, और NGS में उपयोग के लिए एक डीएनए पुस्तकालय तैयार करते हैं । यह दृष्टिकोण मध्यवर्ती आणविक प्रवर्धन कदमों की आवश्यकता को समाप्त करता है. हम भी आरएनए-seq. NGS, जो आरएनए-seq शामिल प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड तैयारी का उपयोग किया गया था के लिए संक्रमित पौधों से mRNA को अलग । इकट्ठे contigs दोनों डेटासेट जैव प्रौद्योगिकी और सूचना (NCBI) न्यूक्लिक एसिड (BLASTn) के लिए बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण के लिए राष्ट्रीय केंद्र का उपयोग करने में Badnavirus taxon से संबंधित पाए गए । हम दो badnavirus प्रजातियों के जीनोम की पहचान24।
हाल के वर्षों में तरीकों की एक किस्म के लिए प्राकृतिक वातावरण जो वायरस की तरह कण (VLP) या वायरस विशिष्ट आरएनए या डीएनए2,3,४४के लिए समृद्ध शामिल है में संयंत्र वायरस जैव विविधता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है, ४५,४६ . इन विधियों NGS और bioinformatic विश्लेषण के बाद कर रहे हैं । इस अध्ययन का लक्ष्य एक खेती संयंत्र में एक आम बीमारी के कारण एजेंट मिल गया था । बीमारी एक अज्ञात वायरस है कि गैर है bacilliform कणों से घिरा हुआ है, और जिसके लिए केवल एक ५६५ बीपी टुकड़ा४७क्लोन किया गया है के परिणाम होने की सूचना दी थी । यह जानकारी पूर्व शोधकर्ताओं के लिए पर्याप्त था काल्पनिक रूप से परिवार Caulimoviridaeके भीतर जीनस Badnavirus को वायरस आवंटित । जबकि पूर्व रिपोर्टों की परिकल्पना है कि भंग लिली में भंग क्लोरोटिक रोग एक badnavirus का परिणाम था, metagenomics इस अध्ययन में उल्लिखित दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम निर्धारित किया है कि बीमारी दो अस्थाई badnavirus प्रजातियों के कारण था24। इस प्रकार, एक metagenome दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक रोग के कारण एजेंट की खोज की ताकत यह है कि हम अब स्थितियों जहां एक से अधिक कारण हो सकता है की पहचान कर सकते हैं ।
डीएनए और आरएनए अनुक्रमण डेटा के संयोजन हमारे दृष्टिकोण पूरी तरह से है और यह भी दर्शाता है कि दो तरीकों का उपयोग कर परिणामों अनुरूप परिणाम झुकेंगे और दो संबंधित वायरस की उपस्थिति की पुष्टि की । हम caulimoviruses के अलगाव के लिए एक संशोधित प्रक्रिया कार्यरत है और एक नमूना है कि वायरस जुड़े न्यूक्लिक एसिड के लिए समृद्ध किया गया था और कि वायरस कैप्सिड के भीतर सुरक्षित थे उत्पादित । एक सेवा प्रयोगशाला को डीएनए sequencing बाहर ले जाने के लिए अनुबंधित किया गया था । डी नोवो अनुक्रमण के लिए आवश्यक अवधारणा है कि डीएनए पोलीमरेज़ फ्लोरोसेंट डीएनए संश्लेषण के क्रमिक चक्र के दौरान एक डीएनए में न्यूक्लियोटाइड लेबल में शामिल है । contigs NGS द्वारा पीछा इकट्ठे एक bioinformatic कुछ contigs है कि वायरस contigs के रूप में पहचान की गई उत्पादन कार्यप्रवाह में प्रस्तुत किया गया । इसके अलावा दो वायरस जीनोम की पुष्टि10,24,४८,४९,५० आरएनए के bioinformatic विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त किया गया था-seq राइबो-घट आरएनए तैयार करने से प्राप्त डेटा. एक दिलचस्प परिणाम जानने के लिए कि डीएनए और आरएनए अनुक्रमण द्वारा बरामद अनुक्रम की आबादी गैर वायरल और वायरल न्यूक्लिक एसिड के समान वितरण प्रदान की गई थी । डीएनए और आरएनए अनुक्रमण के लिए, अनुक्रम का < ०.५% वायरस मूल के थे । वायरस अनुक्रम 78-82% की आबादी के भीतर परिवार Caulimoviridaeके थे । डीएनए और आरएनए अनुक्रमण से इकट्ठे वायरस contigs की तुलना करके, हम दो इकट्ठे जीनोम दोनों डेटासेट में हुई कि पुष्टि की ।
केवल डीएनए अनुक्रमण का उपयोग करने के लिए नए वायरस जीनोम की पहचान का एक चिंता यह है कि badnavirus जीनोम एक खुला परिपत्र डीएनए है । हम surmised कि दृश्यों जीनोम में अतिव्यापी विच्छेदों contigs से जीनोम विधानसभा के लिए बाधाएं मौजूद हो सकता है । डीएनए अनुक्रमण परिणाम के प्रारंभिक परीक्षा के दो समान वायरस जीनोम से पता चला । हम कल्पना की है कि इन जीनोम या तो एक प्रजाति है कि अध्ययन नहीं किया गया है, या दो प्रजातियों के सह एक ही संयंत्र24संक्रमण का प्रतिनिधित्व आनुवंशिक विविधता का प्रतिनिधित्व । इसलिए, NGS डीएनए और आरएनए sequencing द्वारा प्राप्त डेटासेट के सामूहिक bioinformatic विश्लेषण, दो पूर्ण लंबाई जीनोम की उपस्थिति की पुष्टि सक्षम होना चाहिए ।
वहां एक और रिपोर्ट जो metagenomic अध्ययन के लिए संयंत्र homogenates से VLP और न्यूक्लिक एसिड निकालने के लिए एक वैकल्पिक विधि विकसित की है, प्रक्रियाओं के आधार पर फूलगोभी मोज़ेक वायरस से डीएनए ठीक (CaMV; ए caulimovirus)3। यह दृष्टिकोण गैर खेती पौधों में उपंयास आरएनए और डीएनए वायरस अनुक्रम की पहचान की । इस अध्ययन में प्रयुक्त caulimovirus अलगाव प्रक्रिया से व्युत्पंन कदम खेती पौधों की बीमारी के कारण एजेंट की खोज करने के लिए प्राकृतिक रूप से संक्रमित पौधों से24VLP निकालने के लिए व्युत्पंन कदम के विपरीत हैं । दोनों संशोधित तरीकों की सफलता से पता चलता है कि caulimovirus अलगाव के लिए फ्रेमवर्क प्रक्रिया सामांय में संयंत्र वायरस के metagenomic अध्ययन के लिए एक मूल्यवान प्रारंभिक बिंदु हो सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
अनुसंधान विज्ञान और प्रौद्योगिकी की उंनति के लिए ओकलाहोमा सेंटर द्वारा वित्त पोषित अनुसंधान कार्यक्रम चरण द्वितीय AR 132-053-2 लागू किया गया; और कृषि विशेषता फसलों अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम के ओकलाहोमा विभाग द्वारा । हम Dr. HongJin ह्वांग और OSU Bioinformatics कोर सुविधा है जो NSF (EOS-०१३२५३४) और NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 और 5P20RR15564-03) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था धंयवाद ।
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich St. Louis MO | S5976 | Grinding buffer for virus purification |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | Grinding buffer for virus purification |
Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | Grinding buffer for virus purification |
urea | Thermo-Fisher | PB169-212 | Homogenate extraction |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | Homogenate extraction |
Cheesecloth | VWR Radnor, PA | 21910-107 | Filter homogenate |
Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | Pellet resuspension& DNA resuspension buffers |
MgCl2 | Spectrum, Gardena, CA | M1035 | Pellet resuspension buffer |
EDTA | Spectrum | E1045 | Stops enzyme reactions |
Proteinase K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA resuspension buffer |
phenol:chloroform:isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | P2069 | Dissolve virion proteins |
DNAse I | Promega | M6101 | Degrade cellular DNA from extracts |
95% ethanol | Sigma-Aldrich | 6B-100 | Virus DNA precipitation |
Laboratory blender | VWR | 58984-030 | Grind leaf samples |
Floor model ultracentrifuge &Ti70 rotor | Beckman Coulter, Irving TX | A94471 | Separation of cellular extracts |
Floor model centrifuge and JA-14 rotor | Beckman Coulter | 369001 | Separation of cellular extracts |
Magnetic stir plate | VWR | 75876-022 | Mixing urea into samples overnight |
Rubber policeman | VWR | 470104-462 | Dissolve virus pellet |
2100 bioanalyzer Instrument | Agilent Genomics, Santa Clare, CA | G2939BA | Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity |
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip | 5067-1513 | Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip | 5067-4626 | Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
Plant total RNA isolation kit | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | Isolate RNA for RNA-seq |
RNase-free water | VWR | 10128-514 | Resuspension of DNA and RNA for NGS |
RNA concentrator spin column | Zymo Research, Irvine, CA | R1013 | Prepare RNA for RNA-seq |
rRNA removal kit | Illumina, San Diego, CA | MRZPL116 | Prepare RNA for RNA-seq |
DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Prepare RNA for RNA-seq |
RNA enrichment system | Roche | 7277300001 | Prepare RNA for RNA-seq |
Agarose | Thermo-Fisher | 16500100 | Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
Ethidium bromide | Thermo-Fisher | 15585011 | Agarose gel staining |
pGEM-T +JM109 competent cells | Promega, Madison, WI | A3610 | Clone genome fragments |
pFU Taq polymerase | Promega | M7741 | PCR amplify virus genome |
dNTPs | Promega | U1511 | PCR amplify virus genome |
PCR oligonucleotides | IDT, Coralvill, IA | Custom order | PCR amplify virus genome |
Miniprep DNA purification kit | Promega | A1330 | Plasmid DNA purification prior to sequencing |
PCR clean-up kit | Promega | A9281 | Prepare PCR products for cloning |
pDRAW32 software | ACAClone | Computer analysis of circular DNA and motifs | |
MEGA6.0 software | MEGA | Molecular evolutionary genetics analysis | |
Primer 3.0 | Simgene.com | ||
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit | Thermo-Fisher | R11490 | Fluorometric determination of RNA quantity |
GS Junior™ pyrosequencing System | Roche | 5526337001 | Sequencing platform |
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) | Roche | 5996520001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents | Roche | 5996490001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) | Roche | 5996538001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit | Roche | 5996511001 | Reagents for emulsion PCR |
GS Jr Titanium Sequenicing kit* | Roche | 5996554001 | Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads |
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit | Roche | 5996619001 | Sequencing plate with associated reagents and gaskets |
IKA Turrax mixer | 3646000 | Special mixer used with Turrax Tubes | |
IKA Turrax Tube (specialized mixer) | 20003213 | Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions | |
GS Nebulizers Kit | Roche | 5160570001 | Nucleic acid size fractionator for use during library preparations |
GS Junior emPCR Bead Counter | Roche | 05 996 635 001 | Library bead counter |
GS Junior Bead Deposition Device | Roche | 05 996 473 001 | Holder for Picotiter plate during centrifugation |
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices | Roche | 05 889 103 001 | Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation |
GS Junior Software | Roche | 05 996 643 001 | Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data |
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Run Processor v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS De Novo Assembler v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Reference Mapper v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) |