Databas-guidad-flödescytometri för utvärdering av benmärgen myeloida Cell mognad

Summary

MDS diagnosen är svår i avsaknad av morfologiska kriterier eller icke-informativa cytogenetik. MFC kunde bidra till att förfina den diagnostiska processen för MDS. För att bli användbart för klinisk praxis, MFC analysen måste baseras på parametrar med tillräcklig specificitet och känslighet, och data bör vara reproducerbar mellan olika operatörer.

Abstract

En arbetsgrupp som initierats inom franska flödescytometri Association (AFC) utvecklades för att harmonisera tillämpningen av multiparametrar flödescytometri (MFC) för myeloisk sjukdomsdiagnos i Frankrike. Det protokoll som presenteras här var överenskomna och tillämpad mellan September 2013 och November 2015 i sex franska diagnostiska laboratorier (universitetssjukhusen i Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, och Lille och Institut Paoli-Calmettes i Marseille) och tillät en standardisering av benmärgen prov förberedelse och datainskaffning. Tre mognad databaser har utvecklats för neutrofiler, monocytic, och erytroid härstamningar med benmärg från ”friska” givare individer (individer utan bevis på en hematopoetisk sjukdom). En robust metod för analys av varje myeloisk härstamning bör tillämpas för rutinmässig diagnostisk användning. Nya fall kan analyseras på samma sätt och jämfört mot de vanliga databaserna. Således, kvantitativa och kvalitativa fenotypiska avvikelser kan identifieras och dessa ovanstående 2SD jämföras med data av normal benmärg prover övervägas vägledande av patologi. Den största begränsningen är det högre variabilitet mellan data som uppnås med de monoklonala antikroppar erhållits med de metoder utifrån Hybridomteknik tekniker och för närvarande används i klinisk diagnos. Ställer upp kriterier för teknisk validering av de uppgifter som erhållits kan bidra till att förbättra användbarheten av MFC för MDS diagnostik. Fastställandet av dessa kriterier kräver analys mot en databas. Minskningen av prövaren subjektivitet i analys av data är en viktig fördel med denna metod.

Introduction

I avsaknad av fenotypiska markörer specifika att de dysplastiska förändringar som sker i myeloida celler under MDS initiering och progression, har en ny strategi föreslagits under de senaste åren baserat på utvärderingen av den mognad vägar (förändrat uttryck av myeloisk antigener under produktionen av mogen myeloida celler) eller onormala fördelningen av olika celltyper i benmärgen (BM) cell fack^1,2.

Denna artikel presenterar en ny metod för standardiserade tillämpningen av MFC för att upptäcka dysplastiska förändringar i BM myeloida cell fack relaterade till myelodysplastiska syndrom (MDS) eller annan myeloisk blodsjukdomar. Denna studie visar också verktyget att använda mognad databaser för MFC dataanalys.

Standardisering av provet arbetsgången, datainsamling och analys med hjälp av databaserna skulle möjliggöra identifiering av den mest relevanta fenotypiska avvikelser relaterade till dysplastiska förändringar i BM myeloida celler. Därför krävs statistiskt utvalda undergrupper baserat på väl märkta och välkänt format (automatisk befolkningen Separator (APS) diagram, histogram och dot tomter) för att utveckla en analys strategi som kan användas i efterföljande analys rundor. Upptäckten av robust fenotypiska avvikelser i MDS skulle underlätta diagnosen i fall med eller utan minimal morfologiska dysplasi och utan cytogenetiska aberrancies. Identifiering av diskriminerande parametrar möjliggör en minskning av immunophenotypic paneler kan förenkla den nuvarande noter², tillåter deras tillämplighet i klinisk patologi laboratorier.

Den här metoden begränsar de subjektiva tolkningarna av flödescytometri data, som har varit signalerade i MDS diagnos³. Detta steg är en förutsättning för utveckling av automatiserade verktyg för bearbetning och analys av flöde data⁴.

MDS omfattar en heterogen grupp av klonala hematopoetiska stamceller (HSC) sjukdomar där de spliceosome mutationerna samarbeta med specifika epigenetiska modifierare att ge MDS fenotypen. Det är nu känt att, tillsammans med HSC mutationer, andra mekanismer är inblandade i MDS patofysiologi, som avvikande immunmedierad inflammation och interaktioner mellan maligna Förenta och den stromal mikromiljö av BM. Dessa mekanismer är dock fortfarande dåligt förstådd. MDS breda kliniska och biologiska heterogenitet gör diagnos och val av den optimala terapin en utmaning. Under det senaste decenniet har flera studier visat att MFC är ofta mer känsliga att upptäcka dysplasi² än morfologi, men tekniska och ekonomiska begränsningar gör denna teknik svårt att standardisera, med resultat ofta beroende på den erfarenhet av tolk³. Dessutom är det oklart hur MFC kan rubba balansen mot MDS i fall med eller utan minimal morfologiska dysplasi och i avsaknad av cytogenetiska avvikelser eller i gränsfall såsom hypocellular MDS, med en låg blast räkna, från andra icke-klonal BM störningar såsom benmärgssvikt (dvs., aplastisk anemi). Det är också fortfarande svårt att skilja gränsfall av MDS med ett överskott av Blaster från akut myeloisk leukemi (AML). Av alla dessa skäl integrerar de kliniska riktlinjerna inte MFC testning i den slutliga diagnosen MDS. I 2011 rekommenderade den amerikanska nationella omfattande Cancer Network (NCCN) MFC för uppskattning av andelen CD34 + celler, upptäckt av paroxysmal nattlig hemoglobinuri kloner, och förekomsten av cytotoxiska T-celler kloner i hypocellular MDS⁵. Dessa två sistnämnda situationer också innebära ett terapeutiskt mål eftersom kliniska data har visat ett bra svar av dessa patienter på immunsuppressiv behandling⁶. 2017 NCCN riktlinjerna, med hänvisning till internationella arbetar gruppen (IWG) rekommendationer, listade avvikande immunophenotyping upptäckt av MFC bland Co kriterierna för MDS diagnos, men utan att göra någon specifikationer⁶. Den nyligen publicerade WHO-klassifikationen stadgar dessutom att MFC resultaten enbart inte är tillräckligt för att fastställa en primärdiagnos på MDS i avsaknad av avgörande morfologiska och/eller cytogenetiska uppgifter⁷. MFC kan dock användas som en ytterligare test visar dysreglering av myeloida cell mognad mönster och kvantifiera ”avståndet från normala” för en patient vid en viss tidpunkt i sjukdomsförloppet.

Denna metod är tillämplig på kliniska laboratorier intresserade av utvärderingen av dysplasi i BM myeloida celler med MFC immunophenotyping, för att förfina diagnosen MDS eller andra myeloiska sjukdomar med dysplastiska avvikelser.

Protocol

Protokollet som anges nedan har godkänts av den ”Comité de Protection des Personnes” (oberoende etisk kommitté) Sud-Est 1 från universitet sjukhus av Saint-Etienne, Frankrike. 1. Cytometer inställningar Obs: Cytometer inställningarna utfördes enligt Frankrike Flow rekommendationer, i enlighet med EuroFlow förfarande ”EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) för instrumentet Setup och ersättning (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php). <o…

Representative Results

De 54 BM prover som skördats i K-EDTA antikoagulans inkluderades i studien. MFC data analyserades i avsaknad av någon information om patienterna. Retrospektiv studie visade att BM proverna var från 7 friska donatorer (5 hanar och 2 honor med en medianålder av 47,4 [35-48], 11 individer utan tecken på en hematopoetisk sjukdom (8 hanar och 3 honor med en medianålder av 57,9 [35-72]) och 36 fall med olika sjukdomstillstånd: 1 fall med anemi och lågt kreatinin nivå, 3 fall med anemi…

Discussion

Kvaliteten på BM aspirera skulle kunna inverka på de slutliga resultaten. Hemodilution av den BM aspirera snedvrida fördelning av celler i olika stadier av mognad på grund av avsaknad av föräldraparets eller prekursorer celler. Förmodligen anställa en bulk lyseringslösning metod kan hjälpa normalisering av BM enkelarmade för hemodilution i flödescytometrisk flödesanalyser. Dessutom är de kritiska steg för utvärdering av BM myeloisk dysplasi av flödescytometri prov beredning och färgning, datainsamling o…

Materials

BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µl and 200µl
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain