העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק הוכחה-של-קונספט הכדאיות והן את היעילות antitumor של המועבר intrabrain immunotherapies הסלולר.
Abstract
גליובלסטומה (GBM), סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ביותר אגרסיבי אצל מבוגרים, מזוהה בדרך כלל עם פרוגנוזה גרועה, טיפולים יעילים נדיר הוצעו במהלך העשור האחרון. בין המועמדים מבטיחה עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות מקוריות, immunotherapies הסלולר סומנו כמטרות לחסל פולשני ביותר, כימותרפיה-radioresistant תאים סרטניים, סביר מעורב התדרדרות מהירה, חמורה של סרטן זה. לפיכך, administration(s) של effectors תא החיסון GBM-תגובתי allogeneic, כמו לימפוציטים Vϒ9Vδ2 T האנושי, בסביבת הגידול מייצג הזדמנות ייחודית לספק יעיל, המרוכזת סוכני טיפולית ישירות לתוך אתר של גידולים ממאירים במוח. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק של פרה הוכחה הרעיון הכדאיות והן את היעילות antitumor של אלה immunotherapies הסלולר המסתמכים על זריקות סטיאוטטי של לימפוציטים אנושיים allogeneic בתוך intrabrain הגידול מיטות.
Introduction
GBM (מי כיתה אסטרוציטומה הרביעי), הוא סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ואגרסיבי ביותר אצל מבוגרים. למרות טיפולים אגרסיביים המשלבות ניתוח וכימותרפיה -רדיו, GBM נשאר משויך מאוד פרוגנוזה (חציון ההישרדות של 14.6 חודשים ו 2-בן-התמותה > 73%)1. זה עדויות כי יש מעט התקדמות טיפולית יעילה מאומתים מעל העשור האחרון2. בין המועמדים על עיצוב האתר של יעיל יותר אסטרטגיות טיפוליות3,4,5, immunotherapies6 נידונות כעת לאתר ולחסל גידול פולשני ו רדיו/כימותרפיה-עמידים מאוד תאים, חשד על תרומתם מפתח גידול מהיר ולא קטלנית relapse7. אימונולוגי פוטנציאלים שונים היו מזוהה, המוצע עבור immunotherapies, מעורבים טבעי או αβ ששונו או לימפוציטים מסוג T ϒδ כגון GBM ספציפיים גידול אנטיגנים או מולקולות מפגינות8,9, 10. האפשרות לנהל שנבחרו effectors תא החיסון GBM-תגובתי מייצג הזדמנות ייחודית לספק כמויות מוגברות של לימפוציטים ישירות לתוך האתר של ממאירות שיורית. כדי לתמוך באסטרטגיה זו, לאחרונה הראינו כי מודלים בהתבסס על עכברים immunodeficient נושא xenografts orthotopic ראשי GBM האנושי בנאמנות מסכם את הדברים על התפתחות גידולים במוח ב- GBM חולים9,11. יתר על כן, מודלים אלה שימשו כדי להדגים את היעילות antitumor חזקה של לימפוציטים הועבר adoptively Vϒ9Vδ2T allogeneic אנושי.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים ניסיוני קריטי להשגת סטיאוטטי immunotherapies של גידולים במוח, כגון GBM, המבוססת על העברת המאמצת של לימפוציטים מסוג T allogeneic. המאמר מציג: (i) ההגברה של טיפולית allogeneic המערכת החיסונית T לימפוציטים, כמו לימפוציטים אנושיים Vϒ9Vδ2T; (ii) הכנת אלה T לימפוציטים להזרקה; (iii) ההליך עבור ניהול סטיאוטטי בתוך המוח, ליד הגידול. מאמר זה גם מספק תובנה אופן הפעולה של אלה effectors הסלולר לאחר ההזרקה סטיאוטטי.
הגישה הטיפולית המובאת כאן מבוסס על ההזרקה של 20 x 106 אפקטור תאים לכל מנה עבור העכבר immunodeficient נושאות כל המוח. שלב ההרחבה הראשונית במבחנה נדרש לייצר כמויות גדולות של תאים חיסוניים. לכן, לא ספציפית תא הרחבות מבוצעות באמצעות phytohemagglutinin (PHA-L) וכן מוקרן allogeneic מזין תאים: תאים תאי הדם ההיקפית (PBMCs) מן התורמים בריא ותא טרנספורמציה-אפשטיין בר וירוס EBV B-lymphoblastoid קווים (BLCLs), הנגזר PBMCs על-ידי זיהום במבחנה המכילה EBV בתרבות supernatant משורת תאים מרמוסט B95-8, בנוכחות 1 µg/mL וציקלוספורין-א
תאים חיסוניים אפקטור GBM-תגובתי בהשוואה ונבחר במבחנה מבחני9. תאים אלה אפקטור מופעלים, הוגדל באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, על פי הטבע שלהם (למשל, אדם Vγ9Vδ2 T לימפוציטים9 או וירוס אנטי-הרפס אנושית αβ T לימפוציטים12) עם טוהר המינימלי של > 80%, כמו באופן שגרתי נבדק על ידי ניתוח cytometric. ההליך הרחבה תא שיפורטו להלן חל על קבוצות משנה לימפוציטים אנושיים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
העברה המאמצת של נבחרת מקורית או תאים מהונדסים אפקטור המערכת החיסונית מייצג גישה מבטיחה לטפל ביעילות גידולים, כגון סרטן המוח infiltrative, מטפלת הגבלת reactivities נגד תאים שאינם טרנספורמציה15, 16,17,18. עם זאת, מערכת העצבים המרכזית, המ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה הצוות של בית החולים האוניברסיטאי בעלי חיים המתקן (UTE) של נאנט על גידול בעלי חיים, טיפול הסלולר, tissular הדמיה מתקן הליבה של אוניברסיטת ננט (MicroPICell) עבור הדמיה, המתקן Cytometry (Cytocell) של נאנט לסיוע טכני מומחה שלהם. עבודה זו מומן על ידי INSERM CNRS, אוניברסיטת דה נאנט, Institut du הארצי לסרטן (האינקה #PLBio2014-155), le חדר מרווח וחדיש ליגה הלאומית לסרטן (AO InterRegional 2017), האיחוד האירופי עידן-Net Transcan2 (Immunoglio). הצוות ממומן על ידי Fondation pour la Medicale רשרש (DEQ20170839118). עבודה זו מומש בהקשר של LabEX IGO, התוכניות IHU-צ’סטי, נתמך על ידי Investissements סוכנות המחקר הלאומי d’Avenir באמצעות התוכניות ANR-11-LABX-0016-01 ו- ANR-10-IBHU-005, בהתאמה. הפרויקט IHU-צ’סטי נתמך גם על ידי נאנט Metropole ובאזור פיי דה לה לואר. המחברים מודים Chirine Rafia על מתן עזרה בתיקון כתב היד.
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
Riferimenti
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet?. Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
