Митохондрии специализированные рибосомы, которые отличаются от бактериальных и цитоплазматических аналогов. Здесь мы покажем, как можно получить mitoribosomes от их родной отсека в клетках ГЭС. Метод предполагает изоляцию митохондрий от подвеска клеток и последующей очистки mitoribosomes.
Человека митохондрии имеют выделенный набор рибосом (mitoribosomes), которые переводят 13 основных белковых компонентов кодируемых геном митохондриальных комплексов окислительного фосфорилирования. Поскольку все белки синтезируется человека mitoribosomes являются неотъемлемой мембранных белков, человеческие mitoribosomes привязаны к внутренней митохондриальной мембраны в процессе перевода. По сравнению с цитозольной рибосома mitoribosome имеет коэффициент седиментации 55S, половина рРНК содержание, не 5S рРНК и 36 дополнительных белков. Таким образом более высокий коэффициент белка и РНК и нетипичная структура делают человека mitoribosome существенно отличается от его цитозольной коллегой.
Несмотря на центральное значение mitoribosome к жизни не протоколы были доступны для очистки нетронутыми комплекс из линий клеток человека. Традиционно, mitoribosomes были изолированы от митохондрии богатые животных тканей, которые требуют кг из исходного материала. Мы рассуждал митохондрий в делящихся клеток человека HEK293-производные, вырос в среде богатых питательными веществами выражение будет иметь активную митохондриальной перевода и, таким образом, может быть подходящим источником материала для структурного и биохимические исследования mitoribosome. Для изучения его структуры, мы разработали протокол для крупномасштабных очистки нетронутыми mitoribosomes от ГЭС клеток. Здесь мы представляем метод кавитации азота как быстрее, менее трудоемкое и более эффективной альтернативой традиционным механические методы на основе сдвига для лизиса клеток. Это привело к подготовке mitoribosome, что позволило его структурные определения с высоким разрешением, раскрывая состав нетронутым человеческие mitoribosome и его промежуточные сборки. Здесь мы следить за ходом этой работы и представить оптимизированный и более эффективный метод, требующий только ~ 1010 культивируемых клеток ГЭС. Этот метод может использоваться для человека mitoribosomal перевода комплексы, мутанты, контроля качества сборки и mitoribosomal субблоков интермедиатов очистит. Очистка линейно масштабировать десятикратно если необходимо и также применяется для других типов клеток.
Процесс синтеза белков митохондриальных основана на 13 основных mt мРНК, которые переводятся на специализированных mitoribosome мембрана подключенных к каталитической основой дыхательной цепи. Изменения митохондриального геномов и потребность белки вставить co-translationally в мембраны существенно сформировали архитектура рибосомах митохондрий1. Последние с высоким разрешением структуры млекопитающих mitoribosome показал разительно отличается общий вид бактерий коллегой2,3. Частности добавляются по крайней мере 36 митохондрии специфических белков, способствует ~ 1 MDa загородный молекулярной массы, в то время как mt рРНК уменьшен вдвое и весьма разошлись. Структурных перестроек изменить почти всех важнейших функциональных особенностей, которые были ранее общепринятым быть универсально сохраняется4.
Каждый из mitoribosomal подразделений были приобретены новые основные элементы, например, небольшие подразделения включила внутренней mS29 белка ГТФазы в его «голова» региона. ГТФазы деятельности не были найдены в других систем перевода, и структуры показывает, что ГТФазы может иметь определенную роль в Ассамблее субъединица2. 5S рРНК, которая считается важной вехой всех известных рибосомных крупных подразделений, составляющих ядро центральной выпуклости, отсутствует в млекопитающих mitoribosome и принял mt тРНК Валь как составной строительный блок вместо2. Пан и коллеги показал, что свинину mitoribosome МТ тРНК Пхе и не-вал5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk и коллеги последовали за вверх на этих данных и обнаружил, что mitoribosomes у пациентов с нарушенной mt тРНК Валь стабильность в принципе может вместить mt тРНК ПТО6,7. Почему mitoribosomes включили эти конкретные элементы и какие пути и транс-факторы необходимы для эти уникальные сборки остаются неизвестными.
В целом высокая сложность человеческого mitoribosome, новых белковых компонентов и уникальные ассоциации mt-tRNA как структурный элемент подразумевает участие еще неизвестных митохондрии конкретных транс –факторов. Однако потому что многие из особенностей этой системы являются уникальными для митохондрий, которые традиционно были трудно расследовать8, мало что известно о механизме молекулярных и контроля качества. С развитием анализа высокого разрешения одной частицы электронов крио микроскопия (крио ЭМ)20теперь возникают возможности всесторонне изучать молекулярные механизмы, лежащие в основе Ассамблея, действий и контроль качества человека mitoribosome. Наш доклад о структуре первого человека mitoribosome Ассамблеи промежуточных обеспечивает признание, что это можно представить как образуется человеческого mitoribosome и показывает, что крио Эм играет важную роль в выявлении новых транс– Исполняющий обязанности Ассамблеи факторы9.
Чтобы расширить этот первоначальных усилий, мы описываем быстрый протокол для очистки человека mitoribosome в деталях. В первой части протокола описан крупномасштабных изоляции высоки чисто нетронутыми митохондрий от подвеска клеток. Эта процедура требует 9 h и можно легко изменить и адаптированные для различных типов клеток и весы. Значительный шаг в этот протокол является использование азота кавитации взломать клетки. Второй частью протокола был разработан для очистки mitoribosomes. Эта процедура требует 7 h и дает достаточное количество mitoribosomes биохимических и структурных исследований. Использование чистого митохондрий как исходный материал предлагает высокое качество окончательной подготовки и могут быть экстраполированы на других митохондриальных макромолекул.
Что касается источник исходного материала, хотя относительно легкая доступность животных тканей, которые известны своим богатым источником митохондрий, делает его популярным выбором для mitoribosomes3,5,12, 13, они не могут быть генетически модифицировать и легко воспроизвести в лаборатории. Следовательно существует четко практическая необходимость в разработке протоколов, связанных с линий однородно культивируемых клеток человека. Основное различие между протоколами, занимающихся культивируемых клеток и тканей является режим лизис и гомогенизации. Для культивируемых клеток, выращивается как однослойная типичный метод-тефлон/стекло dounce гомогенизации14. Для малых масштабах15были разработаны оригинальные протоколы подготовки пока эффективной. Прямого расширения масштабов использованием гомогенизатора с емкостью 500 мл можно11, однако, она требует ~ 2 h ручного труда добиться лизиса 80%. Это представил по крайней мере три вопроса: агрегации органеллы благодаря длительное время ожидания, неоднородность лизис вследствие тяжелого материала, тонущий в нижней части большого судна, Отопление образца из-за необходимости несколько strokes. Таким образом предпочтительным методом лизис использует азота кавитации, которая основана на декомпрессии с давлением судно16,17. В этом методе клетки сначала увеличилось в холодной комнате для того, чтобы смягчить клетки и сделать их более восприимчивыми к lysis. Как они помещены в устройство кавитационного азота на буфер, содержащий сахарозы и маннитола добавляется для того, чтобы поддерживать осмотического давления, которая поможет сохранить нетронутыми митохондрий. Устройство кавитационного азота затем под давлением с большим объемом свободного кислорода азота, которая растворяется в клетки. Как давление выпустила азота пузырьки из решения позволило в сверлении клеточных мембран. Этот метод предлагает несколько преимуществ по сравнению с механической гомогенизации методами с участием касательные напряжения и трения следующим: 1) избегать любой внешней физической нагрузки на клетки; 2) адиабатического расширения, который охлаждает образца, обеспечивает не теплового повреждения органеллы; 3) клеток компоненты защищены от окисления азота инертного газа; 4) без изменения рН приостановки среды; 5) процесс единообразного и воспроизводимые, потому что те же самые разрушительные силы применяются внутри каждой клетки и всей выборки; 6) процесс быстро и может быть завершена в течение 20-30 мин.
Изоляция митохондрий от культивируемых клеток и тканей была описана в литературе широко, и он основан на разрушения нежный клеток, последовала серия дифференциальной centrifugations. Большинство используемых в настоящее время протоколов Следуйте оригинальной процедуры, разработанные в середине прошлого века18. В то время как основные биохимические подходы являются правильными, есть несколько заблуждений, которые выделены в литературе и оставались незамеченными. Для оптимизации протокола для mitoribosomes, мы систематически расследовать сообщения о общие принципы и заключить, что: 1) включение мг2 + и+ K в буфере не имеет решающее значение. Утверждалось, что KCl помогает предотвратить цитоплазматических белков от формирования гель19, однако, обеспечивает достаточно разрежения, как описано в наших протокол, это явление не происходит. Кроме того исключение мг2 + является полезным для уменьшения загрязнений на рибосомах цитоплазмы20; 2) нет необходимости держать максимально возможный объем соотношение клеток к средству защиты выпустила органеллы от гипо осмотического окружающей среды. Осмотического в нашей протокол достаточно поддержка буферов, содержащих сахарозу и разбавления клеток с буфером изоляции митохондрии (шаг 2.II.5) имеет решающее значение для эффективного разделения органеллы в широкомасштабной подготовки.
PH буфера изоляции митохондрий близка физиологические показатели, т.е. 7,5, который также является оптимальный рН для подготовки следующих mitoribosome. Вяжущих ЭДТА и EGTA добавляются к изоляции СМИ хелат загрязняющих ионов, и они хелат бесплатно магния и кальция, соответственно. Он обсуждался, что включение ЭДТА может привести к повреждению внутренней митохондриальной мембраны14, поэтому концентрация ограничено до 1 мм в качестве меры предосторожности. Мы не наблюдали никакой разницы при использовании 5 мм ЭДТА в окончательной очистки шаг градиента плотности сахарозы.
Протокол, в описанный здесь использует HEK293S-производные человеческих клеток для очистки mitoribosome. Качество подготовки позволяет полученные образцы должны расследоваться биохимически и структурно атомной резолюции. Это позволяет применять метод для человека mitoribosomal перевода комплексы, контроля качества сборки и mitoribosomal субблоков интермедиатов. Кроме того поскольку раковые клетки усиленный OXPHOS емкости и повышенной митохондриальных белок перевода по сравнению с прилегающих тканей стромальные21, mitoribosomes являются целями установленными наркотиков для рака22. Таким образом используя этот протокол для конкретного очищения mitoribosomes в присутствии ингибиторов будет иметь медицинских приложений. Кроме того mitoribosomal перегласовок были связаны с наследственных митохондриальных болезней23. Поскольку эти мутации оказывают прямое воздействие на структуры, представленный здесь подход будет полезен для их структурных характеристик. Протокол можно экспериментально и применяется для различных научных вопросов, борьба фундаментальное понимание перевода человека митохондрий и медицинское значение.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Шведским фондом для стратегических исследований (будущее лидеров Grant FFL15:0325), Рагнар Söderberg Foundation (стипендия в медицине M44/16), Шведский научно-исследовательский совет (× 2015-04107 начиная Грант NT), FEBS долгосрочных стипендий (SA) , H2020-МСКА-ITN-2016 проекта 721757 (VS).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |