Las mitocondrias han especializado los ribosomas que divergieron de sus contrapartes bacterianas y citoplasmáticas. Aquí mostramos cómo mitoribosomes puede obtenerse su compartimiento nativo en las células HEK. El método implica el aislamiento de las mitocondrias de las células de suspensión y consiguiente depuración de mitoribosomes.
Las mitocondrias humanas poseen un conjunto dedicado de los ribosomas (mitoribosomes) que se traducen en 13 componentes de proteína esencial de los complejos de la fosforilación oxidativa codificados por el genoma mitocondrial. Puesto que todas las proteínas sintetizadas por mitoribosomes humanos son proteínas integrales de membrana, mitoribosomes humanos están atados a la membrana interna mitocondrial durante la traducción. En comparación con el ribosoma citosólico el mitoribosome tiene un coeficiente de sedimentación de 55 años, mitad del contenido de rRNA, no rRNA 5S y 36 proteínas adicionales. Por lo tanto, un cociente más alto de la proteína al RNA y una estructura anormal hacen el mitoribosome humano substancialmente diferente de su contraparte citosólica.
A pesar de la importancia central de la mitoribosome a la vida, no hay protocolos estaban disponibles para purificar el complejo intacto de líneas celulares humanas. Tradicionalmente, mitoribosomes fueron aislados de los tejidos animales ricos en mitocondrias que requirió kilogramos de material de partida. Razonamos que las mitocondrias en la división de las células humanas derivadas de HEK293 cultivadas en medio rico en nutrientes expresión tendrían una traducción mitocondrial activa y, por tanto, podrían ser una fuente adecuada de material para los estudios estructurales y bioquímicos de la mitoribosome. Para investigar su estructura, hemos desarrollado un protocolo para la purificación a gran escala de mitoribosomes intacta de células HEK. Adjunto, presentamos el método de cavitación de nitrógeno como un más rápido, menos intensivo y más eficiente alternativa a la tradicionales mecánicos esquileo métodos de lisis celular. Esto dio lugar a preparativos de la mitoribosome que permitió su determinación estructural de alta resolución, revelar la composición de la mitoribosome humana intacta y sus intermediarios de la Asamblea. Aquí, nos dar seguimiento a este trabajo presentar un optimizado y más rentable método requiere solamente ~ 1010 cultivadas las células HEK. El método se puede emplear para purificar humano mitoribosomal traducir complejos, mutantes, conjuntos de control de calidad y mitoribosomal subunidades intermedios. La purificación puede ser linealmente aumentada diez veces si es necesario y también se aplica a otros tipos de células.
El proceso de síntesis de proteínas mitocondriales se basa en 13 mt-mRNAs esenciales que se traducen por una mitoribosome unida a membrana especializada para formar el núcleo catalítico de la cadena respiratoria. El genoma mitocondrial alterado y la necesidad de las proteínas insertar co-translationally en la membrana sustancialmente han moldeado la arquitectura de los ribosomas mitocondriales1. Estructuras de alta resolución reciente de lo mamífero mitoribosome mostraron un aspecto general muy diferente a la contraparte bacteriana2,3. Particularmente, se agregan proteínas específicas de las mitocondrias por lo menos 36, aportando masa molecular extra de la MDa de ~ 1, mientras que mt-rRNA es reducido por doble y altamente divergieron. Los cambios estructurales alteran casi todas características funcionales que previamente fueron aceptadas generalmente ser universalmente conservado4.
Nuevos elementos principales han sido adquiridos por cada una de las subunidades de la mitoribosomal, por ejemplo, la subunidad pequeña ha incorporado una intrínseca GTPasa proteína mS29 en su región de ‘cabeza’. Actividad GTPasa no ha sido encontrado en otros sistemas de traducción, y la estructura indica que la GTPasa puede tener un papel en subunidad Asamblea2. El rRNA 5S que se consideraba un hito de subunidades grandes ribosomales conocidos todos, formando la base de la protuberancia central, falta en lo mamífero mitoribosome y ha adoptado a mt-tRNA-Val como un bloque de construcción integral en vez de eso2. Ban y sus colegas demostraron que la mitoribosome porcina tiene mt-tRNA-Phe y no – Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk y colegas seguimiento a estos datos y encontraron que mitoribosomes de pacientes con estabilidad mt-tRNA-Val comprometido en principio caben Phe-tRNA-mt6,7. Por ello los mitoribosomes han incorporado estos elementos específicos y vías y transporte-factores se requieren para estas asambleas únicas siguen siendo desconocidas.
En general, la alta complejidad de la mitoribosome humano, nuevos componentes de la proteína y la asociación única de la mt-tRNA como elemento estructural implica la implicación de factores aún desconocidos mitocondria específica trans. Sin embargo, porque muchas de las características de este sistema son únicas a las mitocondrias, que tradicionalmente han sido difíciles de investigar8, poco se sabe sobre el mecanismo molecular y control de calidad. Con el desarrollo de análisis de alta resolución sola partícula electrón crio-microscopía (cryo-EM)20, ahora surgen oportunidades para estudiar exhaustivamente los mecanismos moleculares subyacentes a la Asamblea, acción y control de calidad del ser humano mitoribosome. Nuestro informe de la primera estructura de la Asamblea de la mitoribosome humana intermedia proporciona el reconocimiento de que es posible visualizar cómo se forma la mitoribosome humana y muestra que cryo-EM es fundamental para la identificación de nuevas trans– Asamblea actuando factores de9.
Para ampliar este esfuerzo inicial, se describe un protocolo rápido para la purificación del mitoribosome humano en detalle. En la primera parte del Protocolo, se describe un aislamiento a gran escala de las mitocondrias intactas altamente puros de las células de suspensión. Este procedimiento requiere 9 h y puede ser fácilmente modificado y adaptado a escalas y diferentes tipos de células. Un paso importante en este protocolo es el uso de la cavitación de nitrógeno para romper las células. La segunda parte del protocolo fue desarrollada para purificar mitoribosomes. Este procedimiento requiere de 7 h y produce una cantidad suficiente de mitoribosomes para estudios bioquímicos y estructurales. Uso de mitocondrias puras como materia prima ofrece preparativos finales de alta calidad y puede ser extrapolada a otras macromoléculas mitocondriales.
Con respecto a la fuente de material, de partida aunque la relativamente fácil disponibilidad de los tejidos animales que se sabe que son una fuente rica en mitocondrias, es una opción popular para mitoribosomes3,5,12, 13, no puede ser genéticamente modificados y reproducidos fácilmente en el laboratorio. Por lo tanto, hay una necesidad clara práctica para el desarrollo de protocolos que implican líneas de células humanas cultivadas homogéneo. La principal diferencia entre los protocolos de ocuparse de los tejidos y células cultivadas es el modo de lisis y homogeneización. Para las células cultivadas que se cultiva como una monocapa, un método típico es vidrio Teflon dounce homogeneización14. Los protocolos de preparación original mientras que eficiente fueron desarrollados para pequeñas escalas15. Una ampliación directa utilizando un homogenizador con capacidad de 500 mL es posible11, sin embargo, se requiere ~ 2 h de mano de obra para lograr la lisis del 80%. Esto introdujo por lo menos tres cuestiones: agregación de orgánulos debido a largos tiempos de espera, lisis no homogéneo debido a material pesado que se hunde hasta el fondo de un vaso grande, calefacción de la muestra debido a la necesidad de múltiples golpes. Por lo tanto, un método preferible de lisis utiliza cavitación de nitrógeno, que se basa en la descompresión de un recipiente a presión16,17. En este método, las células primero se hinchó en la cámara fría para ablandar las células y hacerlas más susceptibles a la lisis. Como se colocan en el aparato de cavitación de nitrógeno se añade un tampón que contiene sacarosa y manitol para mantener una presión osmótica que ayudará a mantener las mitocondrias intactas. El aparato de cavitación de nitrógeno presurizado entonces con un gran volumen de nitrógeno libre de oxígeno, que se disuelve en las células. Como la presión de las burbujas de nitrógeno liberado de la solución, dando por resultado la ruptura de las membranas celulares. Este método ofrece varias ventajas sobre los métodos de homogeneización mecánicos que implica tensiones de cizallamiento y fricción como sigue: 1) es evitar cualquier estrés físico externo en las células; 2) una expansión adiabática que se enfría la muestra asegura no hay daño por calor a organelos; 3) componentes de la célula están protegidos de la oxidación por el gas inerte nitrógeno; 4) sin alteración del pH del medio de suspensión; 5) el proceso es uniforme y reproducible, ya que las mismas fuerzas disruptivas se aplican dentro de cada célula y a lo largo de la muestra; 6) el proceso es rápido y puede terminar dentro de 20-30 min.
Aislamiento de las mitocondrias de las células cultivadas y los tejidos se ha descrito ampliamente en la literatura, y se basa en una alteración de la célula suave seguida por una serie de centrifugados diferencial. La mayoría de los protocolos utilizados actualmente siga los procedimientos originales desarrollados en el medio siglo anterior18. Mientras que los enfoques bioquímicos básicos son correctos, hay varios conceptos erróneos que se destacó en la literatura y permaneció sin ser detectada. Para optimizar el protocolo para mitoribosomes, sistemáticamente investigado los principios generales divulgados y concluir que: 1) inclusión de Mg2 + y K+ en el buffer no son crucial. Se ha argumentado que la KCl, ayuda a prevenir la formación de un gel de19, sin embargo, proteínas citoplasmáticas proporciona una dilución suficiente como se describe en nuestro protocolo, este fenómeno no ocurre. Además, es útil para reducir la contaminación por los ribosomas citoplasmáticos20; exclusión de Mg2 + 2) no hay necesidad para mantener el cociente del máximo volumen posible de células al medio para proteger los organelos lanzados desde el entorno de hypo-osmótica. El apoyo osmótico en nuestro protocolo es suficientemente proporcionado por buffers que contengan sacarosa y la dilución de las células con buffer de aislamiento de las mitocondrias (paso 2.II.5) es esencial para la eficiente separación de organelos en una preparación a gran escala.
El pH del buffer de aislamiento de las mitocondrias está cerca de los valores fisiológicos, es decir, 7.5, que es el pH óptimo para la siguiente preparación de mitoribosome. Agentes EDTA y EGTA se añaden a los medios de aislamiento a quelar iones contaminantes y quelato magnesio libre y calcio, respectivamente. Se ha discutido que la inclusión de EDTA puede conducir al daño de la membrana mitocondrial interna14, por lo tanto, la concentración está limitada a 1 mM como medida de precaución. No hemos observado ninguna diferencia cuando se utiliza EDTA de 5 mM en el paso de la purificación final del gradiente de densidad de sacarosa.
El protocolo descrito en el presente documento utiliza células humanas derivadas de HEK293S para la purificación de la mitoribosome. La calidad de la preparación permite la muestra obtenida ser investigada bioquímicamente y estructuralmente a resolución atómica. Esto permite aplicar el método a mitoribosomal humano traducir complejos, conjuntos de control de calidad y productos intermedios de subunidades de mitoribosomal. Por otra parte, puesto que las células cancerosas han amplificado capacidad OXPHOS y traducción proteína mitocondrial elevada en comparación con tejido estroma adyacente21, mitoribosomes son blancos de drogas establecido para cáncer22. Por lo tanto, usando este protocolo para la purificación específica de mitoribosomes en presencia de inhibidores tendrá aplicaciones médicas. Además, las mutaciones mitoribosomal se han relacionado con enfermedades hereditarias mitocondriales23. Puesto que estas mutaciones tienen efectos directos sobre la estructura, el enfoque presentado aquí será útil para su caracterización estructural. El protocolo puede ser experimentalmente ampliado y aplicado a una variedad de cuestiones científicas para abordar la comprensión fundamental de la traducción en la mitocondria humana y su importancia médica.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la Fundación sueca para la investigación estratégica (futuro líderes Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Fundación (beca en medicina M44/16), Consejo de investigación sueco (Starting Grant NT × 2015-04107), FEBS a largo plazo beca (SA) , Proyecto H2020-MSCA-ITN-2016 721757 (VS).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |