Este protocolo describe los pasos necesarios para diseñar y realizar targeting multiplexados de potenciadores con la desactivación proteína de fusión SID4X-dCas9-Cascarudo, también conocido como interferencia de enhancer (potenciador-i). Este protocolo permite la identificación de los reforzadores que regulan la expresión génica y facilita la disección de las relaciones entre los potenciadores de regulación de un gen de destino común.
Múltiples potenciadores a menudo regulan un determinado gen, sin embargo, para la mayoría de los genes, no queda claro qué Reforzadores para expresión génica, y cómo estos potenciadores se combinan para producir una respuesta transcripcional. Como millones de potenciadores han sido identificados, se necesitan herramientas de alto rendimiento para determinar la función de mejorador en una escala genoma-ancha. Los métodos actuales para estudiar la función del reforzador incluyen hacer supresiones genéticas utilizando el dominio nucleasa Cas9, pero es difícil estudiar los efectos combinatorios de múltiples potenciadores usando esta técnica, como múltiples líneas de células clonales sucesivas deben estar generados. Aquí, presentamos Enhancer-i, un método basado en la interferencia de CRISPR que permite la interrogación funcional de múltiples potenciadores simultáneamente en sus locus endógenos. Enhancer-i hace uso de dos dominios represivos fusionados a nucleasa-deficiente Cas9, SID y KRAB, para lograr la desactivación de reforzador mediante desacetilación de las histonas en loci específicos. Este protocolo utiliza transitorios de la transfección de guía RNAs para permitir que la inactivación transitoria de regiones específicas y es particularmente eficaz en bloquear las respuestas transcripcionales inducibles a estímulos en lugares de cultivo de tejidos. Reforzador es altamente específico tanto en su orientación genómica y sus efectos sobre la expresión génica global. Resultados obtenidos en este protocolo ayudan a comprender si un reforzador está contribuyendo a la expresión génica, la magnitud de la contribución, y cómo el aporte se ve afectado por otros potenciadores cercano.
Proyectos como codificar1, Roadmap Epigenomics2y FANTOM de secuenciación a gran escala3 han identificado millones de supuestos potenciadores dentro del genoma humano a través de cientos de tipos celulares. Se estima que cada promotor se asocia con un promedio de 4,9 potenciadores y cada reforzador entra en contacto con un promedio de 2,4 genes3, sugiriendo que la expresión génica es a menudo el resultado de la integración de múltiples interacciones reguladoras distribuidas. Un reto importante restante es definir no sólo como individuales potenciadores contribuyen a la expresión génica, pero cómo combinan para afectar la expresión. Enfoques genéticos se utilizan para identificar las relaciones entre reforzadores en organismos modelo de Drosophila4 ratones5. Sin embargo, estos experimentos son desperdiciadoras de tiempo y de bajo rendimiento para el estudio de múltiples potenciadores en múltiples genes.
Un enfoque para estudiar la función del reforzador a gran escala implica ensayos reportero masivamente paralelo. Estos ensayos permiten la detección simultánea de miles de secuencias de ADN por su capacidad para la expresión de un gen reportero del6. Mientras que estos ensayos han demostrado que secuencia de ADN solo puede ser suficiente para transmitir el gen Reglamento información7, vienen con las salvedades de ser realizada fuera del contexto de la cromatina nativa y con un promotor heterólogo. Además, el tamaño de la secuencia de la DNA están analizando en ensayos reportero masivamente paralelo suele basepairs menos de 200, que puede excluir la pertinente secuencia circundante. Lo importante, como ensayos reportero sólo medir la actividad de una secuencia a la vez, no toman en cuenta las complejas relaciones que pueden existir entre reforzadores. Así, mientras que ensayos reportero masivamente paralelo pueden ser informativos sobre la actividad intrínseca de una secuencia de ADN, ellos no necesariamente nos informan de la función de esa secuencia de ADN en el contexto del genoma.
Recientemente desarrollados CRISPR/Cas9 herramientas8 han facilitado el estudio de la regulación génica, ya que permiten la supresión de los reforzadores en el locus endógeno. Sin embargo, eliminar reforzadores múltiples al mismo tiempo puede conducir a inestabilidad genómica y es lento para generar deleciones sucesivas potenciador en una línea celular única. Además, nueva secuencia genómica se crea en el sitio de la eliminación después de la reparación, y esta secuencia puede tener función reguladora. Una versión alternativa de Cas9 ha sido desarrollada específicamente para la modulación de la expresión génica, confiando en fusiones de9,10 de activación o represión de11,12 dominios a nucleasa-deficiente forma de Cas9 (dCas9). Estas proteínas de fusión son ideales para el estudio de múltiples loci simultáneamente como físicamente no alterar la secuencia del ADN y en su lugar modular Epigenética para interrogar a una región reguladora. La fusión represiva más ampliamente utilizada es KRAB, que recluta el KAP1 represor Co complejo, promover la deposición de la represión asociado histona H3 lisina 9 trimetilación (H3K9me3)13. dCas9-Cascarudo, también conocido como CRISPR interferencia14ha sido utilizado para blanco y pantalla individuales potenciadores para sus contribuciones a la expresión de gene de15,16; sin embargo, no ha sido optimizado para apuntar varias regiones al mismo tiempo. Una versión de multiplex interferencia CRISPR para potenciadores, seq mosaico17, usa sola célula RNA-seq como una lectura, pero esta tecnología es costosa y sólo es adecuado para el estudio de genes altamente expresados debido a la baja sensibilidad de la célula RNA-seq.
Se intentó desarrollar un método basado en la interferencia de CRISPR para disección función combinatoria potenciador en el contexto de una respuesta transcripcional a los estrógenos. Aproximadamente la mitad de genes estrógeno-responsivos contienen potenciadores 2 o más obligados por la alfa del receptor de estrógeno (ER) cerca de18, sugiriendo que múltiples potenciadores se pueden participar en la respuesta al estrógeno y entender que la lógica reguladora requeriría dirige a reforzadores múltiples simultáneamente. Como estudios iniciales mediante interferencia CRISPR en promotores sugieren que promotores no todos responden igual a represión mediada por KRAB19, razonamos que la adición de un dominio represivo distinto a dCas9 puede facilitar la desactivación de diversos potenciadores. Elegimos el Sin3a interacción dominio de Mad1 (SID)20 ya que conduce al reclutamiento de las histona deacetilasas21, que quitan grupos acetil de las histonas que se asocian con actividad transcripcional. Importante, el dominio SID fue eficaz para reducir la expresión del gen cuando fusionan dCas922 y23de la relatos y Sin3a ha demostrado ser un potente factor de cooperación represivo en una variedad de contextos de secuencia enhancer24. Se utilizó SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) a 10 diferentes potenciadores por el ER e identifican los sitios de unión de ER (ERBS) que son necesarios para la respuesta transcripcional de estrógeno a los 4 genes18. Hemos dirigido también las combinaciones de potenciadores para identificar los sitios que cooperan en la producción de la respuesta transcripcional de estrógeno. Hemos encontrado que hasta 50 sitios pueden potencialmente ser objeto simultáneamente con los cambios de expresión genética detectable. Uso de ChIP-seq y RNA-seq, demostramos que el reforzador es una técnica altamente específica para estudiar simultáneamente múltiples potenciadores.
En este protocolo se describen los pasos involucrados en la realización de reforzador-i, una técnica flexible que permite el estudio funcional de reforzadores múltiples simultáneamente en un entorno de cultivo de tejidos. Enhancer-i está correlacionada altamente con la canceladura genética pero proporciona desactivación transitoria que depende de las histonas deacetilasas (HDACs). Entregar guía RNAs mediante transfección transitoria frente a integración estable a través de vectores virales, este protocolo evita la deposición y difusión potencial de H3K9me3. Este diseño de guía RNA detalles de protocolo y clonación vía Asamblea de Gibson, la transfección de guían RNAs usando lipofection, y el análisis de la expresión génica resultante cambia por qPCR. También se incluyen los métodos para evaluar la especificidad del reforzador-i dirigido a nivel de genoma y transcriptoma. Mientras que esta técnica se desarrolló para estudiar la regulación génica por ER límite potenciadores en líneas celulares de cáncer humano, es aplicable a la disección de cualquier mamífero enhancer.
Este protocolo describe un método simple y flexible para disección función del reforzador en el locus genómico endógena sin alterar físicamente la secuencia del ADN. Mientras que es similar en concepto a los previamente publicados protocolos de interferencia CRISPR usando dCas9 KRAB27, potenciador-i diferencia de estos protocolos de 3 maneras principales. En primer lugar, potenciador-i utiliza el dominio interacción SIN3A de MAD120 para lograr la desactivación de potenciador. Desactivación de Enhancer puede rescatar mediante inhibidores de las HDACS, sugiriendo que el principal mecanismo de desactivación es dependiente de las HDACS. A diferencia de la interferencia CRISPR dCas9 KRAB, potenciador-i no conduce a la deposición de H3K9me3. Esto es probable debido a que i potenciador depende introducción transitoria de guía RNAs, con las células se cosechan a los 3 días post transfección. En interferencia CRISPR, se observa un aumento de H3K9me3 en 7 días post transducción12. Finalmente, el protocolo de reforzador-i ofrece una estrategia para atacar simultáneamente varios sitios y monitorear la eficiencia de la focalización. En seq mosaico17, dCas9 KRAB es objetivo reforzadores múltiples simultáneamente, pero esta técnica se basa en la secuencia de RNA unicelular para identificar cambios de expresión, y muchos genes (por ejemplo de genes estrógeno-responsivos) pasan desapercibidos debido a la baja sensibilidad de unicelular RNA-SEQ Enhancer-i proporciona un método confiable para estudiar potenciadores individualmente y en combinación para cualquier gen.
El paso más crítico del reforzador-i es la transfección, que debe ser optimizada para la línea celular de interés. Este protocolo se basa en tratamiento de puromicina para enriquecer las células transfected, pero es posible que co transfecting guía RNAs con una proteína fluorescente y clasificación de células fluorescentes mediante citometría de flujo puede llegar a ser un mejor método de enriquecimiento para algunos celulares tipos. Se recomienda control de la expresión a nivel de guía RNAs y SID4x-dCas9-KRAB por qPCR para solucionar problemas y confirmar la transfección. Si los niveles guía RNA son bajos (ciclo umbral > 30), los usuarios también pueden considerar guía alternativa estrategias de producción de RNA como en vitro transcripción28. También es posible que a pesar de niveles altos de gRNA, RNA guía dirigida a de la proteína SID4x-dCas9-KRAB es ineficiente, en cuyo caso seleccionando diferentes guía de secuencias de ARN puede ser necesario. Al realizar el ChIP-seq de la proteína de fusión con la cromatina de células Enhancer-i Tratado, la eficacia de la focalización puede controlarse. Si hay señal de alto de SID4x-dCas9-KRAB en la región de interés, y cambios de expresión en su gen blanco supuesta no se detectan, la región probablemente no contribuyen a la expresión de este gen bajo las condiciones estudiadas.
Una limitación potencial del reforzador-i es que se pueden acumular efectos off-target si muchos sitios están dirigidos al mismo tiempo. Sin embargo, estrategias de interferencia CRISPR para caída tienen menos efectos objetivo de ARNi29, particularmente cuando se utiliza una línea celular policlonales de expresando dCas9 KRAB. Si bien hemos visto objetivo vinculante genómica de SID4X-dCas9-KRAB cuando 10 sitios al mismo tiempo, no hemos identificado cambios de expresión génica como consecuencia de los eventos de enlace. Como podrán en contacto con algunos reforzadores múltiples promotores y potenciadores de otros, es posible que muchos genes pueden cambiar la expresión en contra de un solo reforzador, aunque no está claro si esta forma de regulación génica es común. Para confirmar que los cambios de expresión observaron son debido a la orientación un potenciador específico y no objetivo efectos, los usuarios pueden realizar Enhancer-i con dos conjuntos distintos de no superposición guía RNAs a la misma región. Además, la supresión genética de la región utilizando Cas9 nucleasa competente puede confirmar aún más sus efectos sobre la expresión génica.
Como funciones de reforzador-i a través de desacetilación de histonas, es posible que sus capacidades de desactivación se limitan a reforzadores que tienen apreciables niveles de acetilación de histonas. Hay una gran variedad de fusiones represivas alternativa que puede ser más eficaz en el objetivo específicos potenciadores. Fusiones de metiltransferasa de ADN a dCas9 pueden utilizarse para reducir la expresión del gen cuando a distal potenciadores30, pero esta represión no es a menudo transitoria. Otra fusión represiva utiliza el dominio amigo de GATA1 (FOG1), que conduce a la histona H3 lisina 27 trimetilación y reprime la expresión del gen en niveles similares a dCas9 KRAB a través de una variedad de célula líneas y promotores31. Curiosamente, añadiendo más copias de FOG1 a dCas9 reduce el potencial represivo en promotores, sugiriendo que un solo ejemplar del dominio SID puede proporcionar más desactivación de potenciador de los 4 ejemplares utilizados actualmente en Enhancer-i. Es posible que algunos loci pueden beneficiarse de orientación dual por diferentes combinaciones de las anteriores fusiones dCas9. Por ejemplo, represión a largo plazo estable puede lograrse mediante transducción simultánea de dCas9 DNMT3a y KRAB dCas932. La mayoría de estas fusiones represivas sólo ha sido atacada a un locus en un momento, y no queda claro que es más eficaz en la manipulación de múltiples potenciadores simultáneamente.
Enhancer-i, mientras que un método adecuado para el estudio de combinaciones de potenciadores para un puñado de genes, es todavía algo limitado en rendimiento si el usuario desea estudiar supuestos potenciadores para cientos de genes. Futuras aplicaciones de esta técnica incorporará tecnologías basadas en la proyección de imagen para cuantificar simultáneamente múltiples genes en muestras múltiples. Lo importante, estas tecnologías son compatibles con la detección directa de moléculas de ARN de lisado, eliminando la necesidad de aislamiento de RNA desperdiciador de tiempo. Estas adaptaciones facilitarán el interrogatorio de los conjuntos más grandes de potenciadores.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por NIH/NHGRI R00 HG006922 NIH/NHGRI R01 HG008974 a J.G. y el Instituto de cáncer Huntsman. J.B.C. fue apoyado por el programa de capacitación de los NIH en T32GM007464 genética.
ZR 96-well Quick-RNA Kit | Zymo Research | R1053 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step | Applied Biosystems | 4389986 | |
AflII restriction enzyme | NEB | R0520S | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531L | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | |
FuGENE HD | Promega | E2312 | |
DNA Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4013 | |
Buffer RLT Plus | Qiagen | 1053393 | |
b-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
Human: Ishikawa cells | ECACC | 99040201 | |
H3K27ac rabbit polyclonal | Active Motif | 39133 | |
H3K9me3 rabbit polyclonal | Abcam | ab8898 | |
FLAG mouse monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
ER alpha rabbit polyclonal | Santa Cruz | sc-544 | |
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid | Addgene | 51133 | Shen et al., 2014 |
gRNA_cloningVector plasmid | Addgene | 41824 | Mali et al., 2013 |
AflII U6 puromycin plasmid | Addgene | 106404 | Carleton et al., 2017 |
SID4X-dCas9-KRAB plasmid | Addgene | 106399 | Carleton et al., 2017 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads | Kapa Biosytems | KK8420 | |
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | ThermoFisher Scientific | A32959 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
LB Broth | ThermoFisher Scientific | 10855001 | |
Quick-DNA Miniprep Kit | Zymo Research | D3020 | |
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder | NEB | N0050S |