RNA原位杂交法定量分析小鼠脑切片中的替代前 mRNA 拼接方法
Summary
本文介绍了一种利用短反义寡核苷酸检测小鼠脑部替代前 mRNA 拼接模式的原位杂交协议。
Abstract
替代剪接 (AS) 发生在超过90% 的人类基因。一个交替拼接的外显子的表达模式通常是以特定于细胞类型的方式来调节的。由于表达模式通常由 RT PCR 和 rna 序列分析, 使用 rna 样本从细胞的数量分离。原位检测作为一种特定的生物结构的表达模式, 可以通过 RNA原位杂交 (用外显子特异探针) 进行。然而, 这种特殊用途的使用是有限的, 因为替代外显子通常太短, 以设计显子特定的探针。在本报告中, BaseScope 的使用, 最近开发的技术, 采用短反义寡核苷酸在 RNA, 被描述为分析模式在小鼠脑科。用神经纤维瘤1型 (Nf1) 的外显子23a 作为例, 说明短外显子-显像结合探针在小鼠脑切片 RNA 分析中表现出高特异性的鲁棒杂交信号。更重要的是, 用外显子包含和跳过特定探针检测到的信号可以用来可靠地计算在小鼠大脑不同解剖区域Nf1外显子23a 表达式的值拼接的百分比。给出了分析的实验协议和计算方法。结果表明, BaseScope 提供了一个强大的新的工具来评估作为表达模式的原位。
Introduction
替代剪接 (AS) 是一个常见的过程中发生的前 mRNA 成熟。在这个过程中, 一个外显子可以是差异包括在成熟的 mRNA。因此, 通过作为, 一个基因可以产生许多基因编码为不同的蛋白质产品。据估计, 人类基因的92–94% 可替代剪接1,2。基因突变导致的不正常的选择性剪接模式与大量疾病有关, 包括肌萎缩侧索硬化、强直营养不良和癌症3、4。因此, 调查和更好地了解替代剪接调控机制, 以寻求新的人类疾病治疗, 是至关重要的。
通常是以特定于细胞类型的方式来调节的。确定特定基因在给定生物系统中的表达模式是很重要的。然而, 当一个包含许多不同类型细胞的复杂器官 (如大脑或心脏) 被研究时, 这就变得复杂了。在这种情况下, 一个理想的检测系统的选择是 RNA原位杂交 (用组织切片), 因此, 作为特定基因的表达模式可以在许多细胞类型同时检测。事实上, 外显子特定的探针被用来评估替代外显子5,6,7的表达水平。但是, 由于以下原因, 这种方法不太适合作为模式分析。首先, 常规的方法通常使用比 300 bp 长的探针, 而脊椎动物内部外显子 (不是第一个或最后一个外显子) 的平均大小是170核苷酸8,9。其次, 当一个外显子特定探针用于检查内部替代外显子的剪接模式时, 探针检测到的唯一的 mrna 异构体是含有外显子的, 而无外显子的 mrna 异构体无法检测到。因此, 计算替代外显子的 (PSI) 值的拼接百分比是复杂的。此外, 传统的荧光染色通常与多相结合, 降低了检测效率和鲁棒性。例如, 在研究了乙酰胆碱酯酶 (疼痛) mRNA 的应力诱导剪接异构体切换时, 辛被纳入到探头中, 并使用抗辛抗体进行检测。或者, 用碱性磷酸酶/链亲和素共轭和碱性磷酸酶10的基质检测生物素标记探针。两种方法都不使用任何放大策略来提高检测的灵敏度。因此, 检测在低水平表达的 mRNA 转录是很有挑战性的。因此, 需要一个更简单、更健壮的检测系统来分析原位的表达模式。
BaseScope 是在 RNAscope 的基础上发展起来的, 该平台是一个建立良好、应用广泛的检测系统。两种检测系统都采用目标特定的放大技术, 提高了检测11、12的灵敏度。区别于另一种的是目标序列的长度, 这是 BaseScope 的50核苷酸, 300–1,000 核苷酸用于 RNAscope。因此, 有可能设计的探针, 目标外显子-显子的连接, 以检测特定的替代 mRNA 亚型。在目前的研究中, 建立了一个程序, 以检查神经纤维瘤1型 (Nf1) 外显子23a 的表达模式, 在同一实验室13,14,15广泛研究的替代显子。,16,17、在小鼠脑科。结果表明, BaseScope 是研究Nf1外显子 23a原位表达模式的理想系统。由于该检测系统可以被改编为许多替代外显子的表达模式, 它代表了一个强大的新工具在研究中的作为。
Protocol
Representative Results
Discussion
这项通信报告的使用 BaseScope RNA, 以检查作为表达模式的小鼠脑科。结果表明, 小于50核苷酸的反感外显子-显子结探针能更准确地靶向外显子夹杂和跳过亚型。此外, 由此产生的信号可以用来计算一个替代外显子的 PSI。
在程序中测试了一些变体。例如, 通过恒温器切片生成的冰冻组织切片进行了测试, 并证明其在该协议中的应用是成功的。然而, 在这种情况下, deparaffinization 步骤…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国心脏协会 (P50CA150964 援助 0365274B)、国家癌症研究所 [胃肠孢子到 Z.W.]、国立卫生研究院的支持 (研究基础设施共享的仪器授权 S10RR031845位于西储大学的光镜成像设备] 和中国奖学金理事会 [X.G.]。
作者感谢理查德. 李在光镜成像核心为他的帮助与幻灯片扫描。
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
Riferimenti
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