Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación
Summary
Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.
Abstract
Empalme alternativo (AS) ocurre en más del 90% de genes humanos. El patrón de expresión de un exón alternativamente empalmado a menudo está regulado de manera específica de tipo celular. COMO expresión patrones típicamente son analizados por RT-PCR y RNA-seq con muestras de RNA aislados de una población de células. In situ examen de como patrones de la expresión de una particular estructura biológica puede realizarse por el RNA en situ hibridación (ISH) utilizando sondas exón específico. Sin embargo, este uso particular del ISH ha sido limitada porque exones alternativos son generalmente demasiado cortos para el diseño de sondas exón específico. En este informe, el uso de BaseScope, una tecnología recientemente desarrollada que emplea cortos oligonucleótidos antisentidos en ARN ISH, se describe a analizar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Exón 23a de neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) se utiliza como ejemplo para ilustrar que corta exón-exón cruce sondas exhiben señales de hibridación robusto con alta especificidad en el análisis de ARN ISH en secciones de cerebro de ratón. Más importante aún, las señales detectadas con exón específico inserción y saltar las puntas de prueba pueden utilizarse para calcular fiablemente el porcentaje empalmado en los valores de expresión de 23a exón de Nf1 en diferentes áreas anatómicas del cerebro de un ratón. Presentan el protocolo experimental y el método de cálculo para análisis. Los resultados indican que BaseScope proporciona una nueva herramienta poderosa para evaluar como los patrones de expresión en situ.
Introduction
Empalme alternativo (AS) es un proceso común que ocurre durante la maduración del pre-mRNA. En este proceso, un exón puede incluirse diferencialmente en el mRNA maduro. Así, a través de AS, un gen puede generar mRNAs muchos ese código para productos diferentes de proteínas. Se estima que 92 – 94% de los genes humanos sufrir splicing alternativo del1,2. Alternativa anormal empalme patrones resultado de mutaciones genéticas se han ligado a un gran número de enfermedades, como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia miotónica, cáncer3,4. Por lo tanto es crucial investigar y comprender mejor los mecanismos de splicing alternativos en un intento de encontrar nuevos tratamientos de enfermedades humanas.
COMO a menudo se regula de manera específica de tipo celular. Es importante determinar el patrón de expresión de AS de un gen específico en un sistema biológico dado. Sin embargo, esto se complica cuando se estudia un órgano complejo que contiene muchos tipos diferentes de células, como el cerebro o el corazón. En este caso, una opción ideal de sistema de ensayo es RNA en situ hibridación (ISH utilizando) las secciones por lo que el modelo AS de expresión de un gen específico puede ser detectado en muchos tipos celulares simultáneamente. De hecho, se han utilizado sondas exón específico para evaluar los niveles de expresión de un exón alternativo5,6,7. Sin embargo, este enfoque no es adecuado para análisis del patrón por las siguientes razones. En primer lugar, convencionales métodos ISH suelen utilizan sondas de más de 300 bp, mientras que el tamaño promedio de exones internos vertebrados (no primer o último exón) es 170 nucleótidos8,9. En segundo lugar, cuando una sonda de exón específico se utiliza para examinar el patrón de corte y empalme de un exón alternativo interno, la única isoforma de mRNA detectada por la sonda es la que contiene el exón, mientras que la isoforma de mRNA sin el exón no puede ser detectado. Así, el cálculo por ciento empalmado en valor (PSI) para el exón alternativo es complicado. Además, ISH fluorescente convencional a menudo combina ISH con inmunotinción, que reduce la eficiencia de la detección y la robustez. Por ejemplo, en un estudio que investigó la tensión inducida empalme isoform de la conmutación de la acetilcolinesterasa (AChE) mRNA, digoxigenina fue incorporado en la sonda ISH y detectado usando anticuerpo anti-digoxigenina. Alternativamente, la sonda marcada con biotina fue detectado por un conjugado de fosfatasa alcalina/estreptavidina y sustrato para fosfatasa alcalina10. Ni método utiliza cualquier estrategia de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección. Como resultado, es difícil detectar las transcripciones del mRNA que se expresan en niveles bajos. Por lo tanto, es necesario un sistema de análisis ISH más simple y más robusto para analizar patrones de expresión en situ.
BaseScope es un reciente desarrollo basado en la plataforma de RNAscope, una bien establecida y ampliamente utilizado sistema de ensayo ISH. Ambos sistemas de ensayo emplean una tecnología de amplificación específico del destino que aumenta la sensibilidad de detección11,12. Lo que distingue una de la otra es la longitud de la secuencia de destino, que es tan corta como 50 nucleótidos para BaseScope y 300-1.000 nucleótidos de RNAscope. Por lo tanto, es posible sondas de diseño dirigidos a uniones exón-exón para detectar específico alternativo mRNA isoforms. En el presente estudio, se estableció un procedimiento para examinar como patrones de expresión de la neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) exón 23a, un exón alternativo estudiado en el mismo laboratorio13,14,15 , 16 , 17, en secciones de cerebro de ratón. Los resultados demuestran que el BaseScope es un sistema ideal para el estudio de patrones de expresión de Nf1 exón 23a in situ. Como este sistema de análisis puede ser adaptado para analizar como patrones de expresión de muchos exones alternativos, representa una poderosa nueva herramienta en los estudios de AS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta comunicación informa el uso de BaseScope ARN ISH para examinar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Está demostrado que empalme exón-exón de anti-sentido sondas de menos de 50 nucleótidos pueden dirigirse a inclusión de exón y saltar isoformas robusta y específicamente. Además, la señal resultante puede utilizarse para calcular PSI de un exón alternativo.
Se analizaron algunas variaciones en el procedimiento. Por ejemplo, secciones congeladas del te…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association [subvenciones 0365274B a H.L.], Instituto Nacional del cáncer [esporas GI P50CA150964 a Z.W.], institutos nacionales de salud [Oficina de investigación infraestructura compartida instrumentación Grant S10RR031845 a la microscopia ligera imagen instalación en Case Western Reserve University] y China Scholarship Council [a X.G.].
Los autores agradecen a Richard Lee en la base de imágenes de microscopia de luz por su ayuda con la exploración de la diapositiva.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
Riferimenti
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
