En kvantitativ måling av reaktive oksygen arter og Senescence-assosiert sekretoriske fenotypen i Normal menneskelig fibroblaster under folkemengde
Summary
Intracellulær ROS har vist seg å spille en viktig rolle i induksjon av mobilnettet senescence. Her beskriver vi en følsom analysen for kvantifisering ROS nivåer under mobilnettet senescence. Vi tilbyr også protokoller for å vurdere senescence-assosiert sekretoriske fenotypen, som angivelig bidrar til ulike alder-relaterte dysfunksjoner.
Abstract
Mobilnettet senescence har vært ansett som en tilstand av irreversible vekst arrestasjon på konsumpsjon av proliferativ kapasitet eller eksponering for ulike påkjenninger. Nyere studier har utvidet rollen mobilnettet senescence til ulike fysiologiske prosesser, inkludert utvikling, sårheling, immun overvåking og alder-relaterte vev dysfunksjon. Celle syklus arrestasjon er et viktig kjennetegn på mobilnettet senescence, har en økt intracellulær reaktive oksygen arter (ROS) produksjon også blitt demonstrert av for å spille en viktig rolle i induksjon av mobilnettet senescence. I tillegg viste studier at senescent celler ha potent paracrine aktiviteter på nærliggende celler og vev gjennom en senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP). Den store økningen av interessen angående strategier mot mobilnettet senescence understreker behovet for en nøyaktig forståelse av senescence mekanismer, inkludert intracellulær ROS og SASP. Her beskriver vi protokoller for kvantitativt vurdere intracellulær ROS nivåer under H-Ras-indusert mobilnettet senescence ROS-sensitive fluorescerende fargestoff og flowcytometri. Dessuten, introdusere vi følsom teknikker for analyse av induksjon av mRNA uttrykk og sekresjon av SASP faktorer. Disse protokollene kan brukes på ulike mobilnettet senescence modeller.
Introduction
Mer enn 50 år siden, avslørt Hayflick og Moorhead at normale celler inn irreversibel vekst arrestasjon på konsumpsjon proliferativ potensial etter et visst antall celledelinger1. Dette fenomenet er nå kjent som replicative senescence og antas å sterkt korrelerer med organismebiologi aldring2. Selv om progressive erosjon av telomeres er ansett som en viktig årsak til replicative senescence, har ulike mobilnettet påkjenninger, som DNA skade, kreftfremkallende aktivisering og oksidativt stress, blitt rapportert å indusere en annen type mobilnettet senescence kalt “tidlig senescence” eller “stress-indusert senescence”. Interessant, spiller tidlig senescence en potent svulst-undertrykkende rolle ved aktivering av oncogenes som H-Ras og BRAF. Studier av musen modeller og menneskelig vev har produsert sterke bevis som biomarkers av celle senescence fantes hovedsakelig i premalignant lesjoner der kreftfremkallende Ras og BRAF er aktivert, men ble redusert i ondartet kreft som utviklet fra disse lesjonene3,4,5. Utover sin rolle i aldring og svulst undertrykkelse, har mobilnettet senescence vist i tidligere studier å spille en rolle i ulike fysiologiske prosesser, inkludert sårheling, reparasjon av vev, immun overvåking og embryonale utvikling6.
Selv om vekst arrestasjon har vært grundig studert som et kjennetegn på mobilnettet senescence7, antyder en betydelig kropp av bevis at intracellulær reaktive oksygen arter (ROS) bidrar også til mobilnettet senescence8. Høyden av ROS nivåer under ulike typer mobilnettet senescence, inkludert replicative senescence og folkemengde (OIS), opprinnelig ble rapportert tiår siden9,10. En mer direkte, eksogene behandling med en sublethal dose av H2O2 induserer senescence11,12. Hemming av ROS-scavenging enzymer, for eksempel SOD1, forårsaker også tidlig senescence13. Derimot lite ambient oksygen forhold og øke ROS scavenging forsinkelse utbruddet av senescence10,14,15. Disse resultatene indikerer utvilsomt at ROS er viktig meglere eller determinanter av mobilnettet senescence induksjon. Men hvordan ROS bidra til induksjon av mobilnettet senescence og hvordan ROS nivåene er opphøyet i mobilnettet senescence kreve videre etterforskning.
Nyere studier har avdekket at senescent celler har potente paracrine aktiviteter på nærliggende celler og vev gjennom en SASP16,17. I alderen vev fremme senescent celler aldersrelatert vev dysfunksjoner via mange stier gjennom SASP i tillegg til en autonom uttømming av proliferativ celler. Ulike proinflammatory faktorer, for eksempel IL-6, IL-8, TGFβ og matrise metalloproteinases (MMPs), skilles ut av senescent celler, forårsaker aldersrelatert vev dysfunksjoner gjennom svekkelse av vev homeostase, ødeleggelse av vev arkitektur, senescence nabokommunene cellene og sterile betennelse18,19. SASPs kan imidlertid ha gunstige effekter avhengig av biologisk sammenheng. I tillegg avhenger heterogenetic natur SASPs hvilken senescent celle og celle scenen, understreker behovet for ytterligere forskning19.
Her beskriver vi raskere og følsom cytometri-baserte teknikker for å vurdere intracellulær ROS nivåer under OIS. I tillegg er metoder for analyse av SASP faktorer ved hjelp av kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjons (qPCR) og ELISA innført.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi presentert metoder for overvåking intracellulær ROS nivåer under H-Ras-indusert senescence i WI-38 normal menneskelig fibroblaster. Intracellulær ROS nivåer i levende celler kan måles kvantitativt ved hjelp av celle-permeable reagensen DCF-DA og flow cytometri. På mobilnettet opptak, er DCF-DA deacetylated av intracellulær esterases og deretter oksidert av ROS til svært fluorescerende 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCF). DCF fluorescens kan oppdages av flowcytometri med en FL1 detektor (grønn fluorescen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra det nasjonale Research Foundation av Korea (2015R1D1A1A01060839) (til unge Yeon Kim) og National Research Foundation av Korea (NRF) stipend finansiert av Korea regjeringen (MSIT) (nei 2016R1A2B2008887, nei. 2016R1A5A2007009) (til Jeanho Yun).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
Riferimenti
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
- Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
- Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
- Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
- Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
- Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
- Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
- Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
- Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
- Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
- Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
