Intracellulære ROS har vist sig at spille en vigtig rolle i induktion af cellulære ældning. Her, beskriver vi en følsom analyse for kvantificering ROS niveauer under cellulære ældning. Vi leverer også protokoller for at vurdere den gulne-associerede sekretoriske fænotype, som efter sigende bidrager til forskellige aldersrelaterede dysfunktioner.
Cellulære gulne har været betragtet som en tilstand af irreversible vækst anholdelse efter konsumption af proliferativ kapacitet eller udsættes for forskellige belastninger. Nylige undersøgelser har udvidet rolle i cellulære gulne til forskellige fysiologiske processer, herunder udvikling, sårheling, immun overvågning og aldersrelaterede væv dysfunktion. Selv om celle cyklus anholdelse er en kritisk kendetegnende for cellulære gulne, har en øget intracellulær reaktive ilt arter (ROS) produktion også påvist for at spille en vigtig rolle i induktion af cellulære ældning. Nylige undersøgelser afslørede desuden, at senescent celler udviser potent paracrine aktiviteter på tilstødende celler og væv gennem en gulne-associerede sekretoriske fænotype (SASP). Den kraftige stigning i interesse vedrørende terapeutiske strategier mod cellulære gulne understreger behovet for en præcis forståelse af gulne mekanismer, herunder intracellulære ROS og SASP. Her beskriver vi protokoller til kvantitativt at vurdere intracellulære ROS niveauer under H-Ras-induceret cellulære ældning ved hjælp af ROS-følsomme fluorescerende farvestof og flowcytometri. Derudover introducerer vi følsomme teknikker til analyse af induktion af mRNA udtryk og sekretion af SASP faktorer. Disse protokoller kan anvendes til forskellige cellulære gulne modeller.
Mere end 50 år siden, afslørede Hayflick og Moorhead at normale celler Angiv irreversible vækst anholdelse efter konsumption af deres proliferativ potentiale efter et bestemt antal celledelinger1. Dette fænomen kaldes nu replicative gulne og menes at kraftigt korrelerer med kropsligt aging2. Selv om en gradvis udhuling af telomerer betragtes som en væsentlig årsag til replicative gulne, er forskellige cellulære understreger, såsom DNA skader, muterede aktivering og oxidativ stress, blevet rapporteret til at fremkalde en anden type af cellulære gulne kaldet “tidlig ældning” eller “stress-induceret gulne”. Det er interessant, spiller for tidlig ældning en potent tumor-undertrykkende rolle ved aktivering af onkogener som H-Ras og BRAF. Undersøgelser af musemodeller og humant væv have produceret stærke beviser, som biomarkører for celle ældning fandtes overvejende i præmaligne læsioner hvor muterede Ras og BRAF er aktiveret, men var faldet i ondartede kræftformer, der er udviklet fra Disse læsioner3,4,5. Ud over sin rolle i aging og tumor undertrykkelse, har cellulære gulne vist i tidligere undersøgelser til at spille en rolle i forskellige fysiologiske processer, herunder sårheling, væv reparation, immun overvågning og fosterudviklingen6.
Selv om væksten anholdelsen er blevet grundigt undersøgt som kendetegnende for cellulære gulne7, tyder en betydelig række indicier på, at intracellulære reaktive ilt arter (ROS) bidrager også til cellulære gulne8. Udvidelse af ROS niveauer under forskellige typer af cellulære gulne, herunder replicative gulne og onkogen-induceret gulne (OIS), blev oprindeligt rapporteret årtier siden9,10. En mere direkte, eksogene behandling med en subletale dosis af H2O2 inducerer gulne11,12. Hæmning af ROS-scavenging enzymer, såsom SOD1, også forårsager for tidlig ældning13. Derimod lav omgivende ilt betingelser og stigende ROS skylleluften forsinkelse udbrud af gulne10,14,15. Disse resultater viser utvivlsomt, at ROS er vigtigt mæglere eller determinanter for cellulære gulne induktion. Men hvordan ROS bidrage til induktion af cellulære gulne og hvordan ROS niveauer er forhøjede under cellulære gulne kræve yderligere undersøgelse.
Nylige undersøgelser har afsløret, at senescent celler har potent paracrine aktiviteter på tilstødende celler og væv gennem en SASP16,17. I alderen væv fremme senescent celler aldersrelaterede væv dysfunktioner via mange stier gennem SASP ud over en selvstyrende udtynding af proliferativ celler. Forskellige proinflammatoriske faktorer, såsom IL-6, IL-8, TGFβ og matrix metalloproteinases (MMPs), udskilles af senescent celler, forårsage aldersrelaterede væv dysfunktioner gennem forringelse af væv homøostase, ødelæggelse af væv arkitektur, ældning af tilstødende celler og steril betændelse18,19. SASPs kan dog have gavnlige virkninger afhængigt af de biologiske kontekst. Heterogenetic karakter af SASPs afhænger Derudover senescent celletype og celle stadium, understreger behovet for yderligere forskning19.
Her beskriver vi hurtige og følsomme flowcytometri-baserede teknikker til vurdering af intracellulære ROS niveauer under OIS. Derudover introduceres metoder til analyse af SASP faktorer ved hjælp af kvantitative real-time polymerase kædereaktion (qPCR) og ELISA.
Her har vi præsenteret metoder for overvågning intracellulære ROS niveauer under H-Ras-induceret gulne i WI-38 normale humane fibroblaster. Intracellulære ROS niveauer i levende celler kan måles kvantitativt ved hjælp af celle-gennemtrængelige reagenset DCF-DA og flow flowcytometri. På cellulære optagelse, er DCF-DA deacetylated af intracellulære esteraser og efterfølgende oxideres af indtægtsordrer, der skal danne stærkt fluorescerende 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCF). DCF fluorescens kan påvises ved flowc…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Research Foundation Korea (2015R1D1A1A01060839) (til unge Yeon Kim) og National Research Foundation af Korea (NRF) tilskud finansieret af Korea regering (MSIT) (Nej 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (til Jeanho Yun).
REAGENTS | |||
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
FBS | GIBCO | 16000-044 | |
penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
pVSVG | Addgene | 1733 | |
Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
Random Primer | Promega | C118A | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
EQUIPMENTS | |||
0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
Microscope | NIKON | TS100 | |
Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |