JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

المنظفات مطابقة التباين في تجارب نثر النيوترون زاوية صغيرة لغشاء بروتين التحليل الهيكلي والنمذجة Ab منذ البداية

Published: October 21, 2018
doi:
10.3791/57901
, , , , ,
1Neutron Scattering Division,Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry,Georgia Institute of Technology

Summary

هذا البروتوكول يوضح كيفية الحصول على نموذج منخفضة الدقة منذ البداية وتفاصيل الهيكلية بروتين غشاء solubilized المنظفات في الحل باستخدام تشتت الزاوية الصغير النيوترون مع مطابقة على النقيض من مواد التنظيف.

Abstract

الصك ونثر البيولوجية زاوية صغيرة النيوترون في عالية-الجريان “النظائر المفاعل من مختبر أوك ريدج الوطني” مخصصة للتحقيق في المواد البيولوجية، وتجهيز الوقود الحيوي والمواد المستوحاة من السيرة الذاتية تغطي نانومتر إلى جداول طول ميكرومتر. الأساليب المقدمة هنا للتحقيق في الخواص الفيزيائية (أي، حجم وشكل) البروتينات الغشاء (هنا، مياب، حوزتي أسبارتيل إينتراميمبراني من ماريسنيجري ميثانوكوليوس) في إيجاد حلول لتشكيل مذيل المنظفات مناسبة تماما لهذا الصك تشتت النيوترونات زاوية صغيرة، بين أمور أخرى. تقنيات تحديد الخصائص الفيزيائية الأخرى تعيق قدرتهم على معالجة الاشتراكات المنظفات في هيكل معقد البروتين-المنظفات. بالإضافة إلى ذلك، يوفر الوصول إلى “مختبر” بيو-ديوتيريشن قدرات فريدة من نوعها لإعداد الزراعات الواسعة النطاق والتعبير عن البروتينات يسمى الديوتريوم لنثر معزز إشارة من البروتين. لئن كان هذا تقنية لا توفر تفاصيل الهيكلية في الاستبانة، وفجوة المعرفة الهيكلية للبروتينات الغشاء يحتوي على العديد من مجالات البحوث عنونة دون أن يتطلب ذلك القرار قرب الذري. وتشمل هذه المجالات على سبيل المثال، تحديد الدول أوليجوميريك، تشكيل معقدة، التغييرات conformational أثناء اضطراب، وقابلة للطي/تتكشف الأحداث. يمكن سهولة إنجاز هذه التحقيقات من خلال تطبيقات لهذا الأسلوب.

Introduction

بروتينات الغشاء تم ترميزها بما يقدر 30 في المائة من جميع الجينات1 وتمثل أغلبية قوية من أهداف للعقاقير الطبية الحديثة. 2 هذه البروتينات تنفيذ مجموعة واسعة من المهام الحيوية الخلوية،3 ولكن على الرغم من وفرة، وأهمية – لا تمثل سوى حوالي 1 في المائة من مجموع هياكل أودعت في “سيقتضي البحوث” للبروتين الهيكلي المعلوماتية الحيوية (ركسب) بنك البيانات. 4 نظراً لطبيعتها مسعور جزئيا، وقد تم التصميم الهيكلي للبروتينات الغشاء زمنياً صعبة جداً. 5 , 6 , 7

كما يتطلب العديد من التقنيات الفيزيائية الحيوية الجزيئات مونوديسبيرسي في حل للقياس، عزل البروتينات الغشاء من الأغشية الأصلية واستقرار هذه البروتينات في تقليد القابلة لذوبان في الأغشية الأصلية كانت منطقة نشطة للبحث في الآونة الأخيرة العقود. 8 , 9 , 10 هذه التحقيقات أدت إلى تطوير العديد من التجميعات amphiphilic رواية لجعل البروتينات الغشاء، مثل نانوديسكس،11،،من1213 بيسيليس،14،15 وأمفيبولس. 16 , 17 ومع ذلك، استخدام المنظفات المذيلات تظل واحدة من الأساليب الأكثر شيوعاً ووضوحاً لتلبية متطلبات القابلية للذوبان بروتين معين. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 للأسف، لا واحد المنظفات أو السحر مزيج من المنظفات القائم حاليا الذي يفي بجميع بروتينات الغشاء؛ وبالتالي، يجب فحص هذه الشروط تجريبيا للمتطلبات الفريدة لكل البروتين. 26 , 27

الذاتي تجميع المنظفات في الحل أعلاه تركزها مذيل حرجة لتشكيل هياكل تجميعية تسمى المذيلات. المذيلات تتكون من العديد من مونومرات المنظفات (تتراوح عادة ما بين 20-200) مع سلاسل الألكيل مسعور تشكيل نواة مذيل ومجموعات رأسه ماء مرتبة في طبقة شل مذيل تواجه المذيب مائي. قد سلوك المنظفات وتشكيل مذيل كلاسيكي وصف تشارلز تانفورد في تأثير مسعور،28 والأحجام وأشكال المذيلات من المنظفات المستخدمة عادة في غشاء بروتين الدراسات ووصف استخدام تشتت الزاوية الصغير. 29 , ودرست أيضا 30 منظمة المنظفات حول بروتينات الغشاء، ومن المتوقع تشكيل مجمعات البروتين-المنظفات (PDCs) مع المنظفات الجزيئات المحيطة البروتين في ترتيب يشبه المنظفات أنيق المذيلات. 31

وأضاف أحد هو ميزة في استخدام المنظفات يمكن التلاعب بخصائص مذيل الناتجة بإدراج مواد التنظيف الأخرى. يحمل العديد من المنظفات خلط مثالية، واختر خصائص من المذيلات المختلطة قد حتى يمكن التنبؤ بها من مكونات ونسبة الاختلاط. 22 ولكن وجود المنظفات يمكن لا تزال تحديات للخصائص الفيزيائية بالمساهمة في الإشارة الإجمالية. على سبيل المثال، إشارة من المنظفات في PDC مع الأشعة السينية وتقنيات تشتت الضوء، لا يمكن تمييزها تقريبا من البروتين. 32 التحقيقات مع واحد-الجسيمات cryo-إلكترون مجهرية (cryo-م) تعتمد عادة على المحاصرين جزيئات (المجمدة)؛ تفاصيل الهيكلية من البروتين هي لا تزال تحجب بعض المنظفات أو تركيزات عالية من المنظفات التي تضيف إلى الخلفية. 33 نهج بديل نحو تفسير هيكل PDC كاملة (بما في ذلك مواد التنظيف) قد بذلت من خلال الطرق الحسابية التي تسعى إلى إعادة بناء المنظفات حول بروتين غشاء معين. 34

في حالة تشتت النيوترونات، تنتج ترتيب الأساسية-شل المنظفات في مذيل عامل نموذج الذي يسهم في تشتت ملاحظتها. لحسن الحظ، يمكن تغيير مكونات الحل بأنها لا تساهم في بعثرة الملاحظ الصافية. هذه العملية “على النقيض من مطابقة” يتحقق عن طريق استبدال الديوتريوم للهيدروجين لتحقيق كثافة طول تشتت الذي يتطابق مع الخلفية (المخزن). يجب أن يعتبر خياراً حكيما للمنظفات (مع نظرائهم الديوتيريوم المتاحة) ونسبة الاختلاط. المذيلات المنظفات، يمكن تنفيذ هذا الاستبدال باستخدام مطهر مع نفس مجموعة الرأس لكن بعد سلسلة الكيل الديوتيريوم (د-الذيل بدلاً من ذيل ح). نظراً للمنظفات جيدا مختلطة،35 على المجاميع سوف يكون بكثافة طول تشتت التي هي المرجحة الخلد-الجزء متوسط من العنصرين (ح-ذيول وذيول د). عندما هذا التباين المتوسط يتسق مع رئيس الفريق، يمكن أن يقابل هياكل تجميعية موحدة تماما لإزالة جميع المساهمات لنثر الملاحظة.

نحن الحاضرين هنا وضع بروتوكول للتعامل مع تباين النيوترون المذيلات المنظفات بدمج جزيئات المنظفات كيميائيا متطابقة مع سلاسل الألكيل يسمى الديوتريوم. 19 , 36 , 37 يسمح هذا التباين المتزامن كاملة مطابقة مذيل الأساسية وشل، وقدرة فريدة على تشتت النيوترونات. 35 , 38 مع هذا المستوى المكرر إلى حد كبير من التفصيل، مطابقة التباين يمكن تمكين الدراسات خلاف ذلك غير مجد للهياكل بروتين الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذا النهج النقيض مطابقة للنظم الأخرى التي تنطوي على مواد التنظيف، مثل البوليمر تبادل ردود الفعل39 والزيت عن الماء المشتتات أو40 أو حتى غيرها من الوكلاء سولوبيليزينج، مثل بيسيليس،41 البوليمرات الإسهامية نانوديسكس أو42 أو كتلة. نهج مماثل 43 ألف كما ورد في هذه المخطوطة، ولكن استخدام أنواع منظفات واحد مع استبدال الديوتريوم الجزئي على مجموعة الألكيل سلسلة و/أو رئيس، صدر مؤخرا. 37 بينما يمكن توقع هذا إلى تحسين توزيع عشوائي للهيدروجين والديوتريوم في جميع أنحاء المنظفات بالمقارنة مع النهج الذي قدم هنا، عدد محدود من الوظائف المتاحة في مواد التنظيف للاستبدال وخطوتين مطلوب توليف المنظفات يطرح تحديات إضافية للنظر فيها.

الخطوات 1 و 2 من البروتوكول المفصلة أدناه وكثيراً ما تتداخل منذ التجربة الأولى التخطيط يجب أن يتم تقديم اقتراح نوعية. ومع ذلك، يعتبر تقديم الاقتراح هنا كخطوة أولى للتأكيد على أن هذه العملية ينبغي أن تبدأ قبل وقت كاف من تجربة نيوترون. كما تجدر الإشارة إلى أن خطوة أساسية، ينبغي إثبات أنه بهذا الاقتراح، أن يكون توصيف البيوكيميائية والفيزيائية (بما في ذلك الاستقرار والنقاء) من العينة التي تدعم الحاجة إلى دراسات النيوترونات. مناقشة عامة للتشتت النيوتروني زاوية صغيرة (بلا) خارج نطاق هذه المقالة. أ مقدمة موجزة ولكنها شاملة يتوفر في عمل مرجع تم مؤخرا نشر توصيف المواد كوفمان،44 والكتب المدرسية ركزت بيولوجية زاوية صغيرة حلاً شاملا نثر. 45 كذلك تعطي القراءة الموصى بها في جزء المناقشة. تشتت الزاوية الصغيرة يستخدم ناقل نثر ما يسمى Q كالكمية المركزية التي تصف عملية نثر. تستخدم هذه المقالة تعريف مقبول على نطاق واسع Q = 4π سين (θ)/λ، حيث θ هي نصف الزاوية بين الشعاع الوارد ومتناثرة و λ هو الطول الموجي للإشعاع النيوتروني في أنجسترومس. توجد تعاريف أخرى أن استخدام مختلف رموز مثل في ‘ لناقلات تشتت، والتي قد تختلف من 2π عامل أو بواسطة استخدام نانومتر بدلاً من انغستروم (انظر أيضا المناقشة من الشكل 10).

Protocol

1-إعداد وتقديم مرفق النيوترون شعاع الوقت والصك المقترح استشارة على شبكة الإنترنت لتحديد مرافق تشتت النيوترونات التي توفر وصول المستخدم العامة النيوتروني شعاع الوقت، مثل أوك ريدج الوطني المختبرات (رنل). خريطة النيوترون التسهيلات والمعلومات حول النيوترونات البحوث في جميع أنحاء العا?…

Representative Results

ينبغي أن تنقل شعاع الوقت وصك مقترح وضوح كافة المعلومات اللازمة للجنة الاستعراض حيث أنه يمكن إجراء تقييم صحيح للتجربة المقترحة. الاتصالات مع استراتيجية الأمن القومي يقترح العالية للمستخدمين عديمي الخبرة. استراتيجية الأمن القومي تقييم الجدوى الأولية وتقديم الاقتراح دلي…

Discussion

البيولوجيا الهيكلية الباحثين الاستفادة من التقنيات الهيكلية التكميلية مثل نثر الحل للحصول على تفاصيل البيوكيميائية والهيكلية (مثل الشكل والحجم الكلي) من الجزيئات الحيوية في الحل. بلا أسلوب جاذبية خاصة لتحديد هياكل منخفضة الدقة من بروتينات الغشاء، وتركيز أساسية لعلم الأحياء الهيكلية ال…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

مكتب البيولوجية، والبحوث البيئية ودعم البحوث في مركز رنل للبيولوجيا الجزيئية الهيكلية (كسمب) والحيوية-بلا استخدام مرافق دعم “شعبة المرافق المستخدم العلمي”، “مكتب العلوم الأساسية في الطاقة”، و “الإدارة الأميركية” للطاقة. حظي بدعم الأعمال الإنشائية على بروتينات الغشاء في مختبر ليبرمان من المعاهد الوطنية للصحة (DK091357، GM095638) وجبهة الخلاص الوطني (0845445).

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochimica. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -. L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -. L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D., Burgess, R. R., Deutscher, M. P. . Methods in Enzymology. 463, 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. . The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -. X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F., Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. . Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. , 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S., Kaufmann, E. N. . Characterization of Materials. , (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., Cohen, I. R., et al. . Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 1-268 (2017).
  46. . Submitting a Research Proposal Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018)
  47. . Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014)
  48. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  49. . Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018)
  50. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  51. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  52. Larsson, G., Enfors, S. -. O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  53. Artero, J. -. B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  54. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  55. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  56. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z., Kelman, Z. . Methods in Enzymology. 565, 27-44 (2015).
  57. Leiting, B., Marsilio, F., O’Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  58. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  59. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  60. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J., Kelman, Z. . Methods in Enzymology. 565, 3-25 (2015).
  61. Haertlein, M., Kelman, Z., et al. . Methods in Enzymology. 566, 113-157 (2016).
  62. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  63. Naing, S. -. H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  64. . Training Requirements for First Time and Repeat Users Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018)
  65. . Remote Analysis Cluster Available from: https://analysis.sns.gov (2018)
  66. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  67. . Software Suite Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018)
  68. . Software Individual Programs Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018)
  69. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  70. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  71. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  72. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  73. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  74. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  75. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  76. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  77. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  78. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735 (2003).
  79. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L., Mus-Veteau, I. . Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. , 281-301 (2016).

Tags

Keywords: Membrane ProteinSmall-angle Neutron ScatteringContrast MatchingDeuterium LabelingAb Initio ModelingOligomeric StateSizeShapeLow Resolution StructureDetergentScattering Length DensityContrast Match PointE. ColiDeuterated ProteinMinimal MediumBioreactor
check_url/it/57901?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Oliver, R. C., Naing, S., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image