이 프로토콜에는 저해상도 ab initio 모델 및 대비 세제의 일치와 작은 각 중성자 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 세제 solubilized 막 단백질의 구조 정보를 가져오는 방법을 보여 줍니다.
높은 유출 동위 원소 반응 기의 오크 리 지 국립 연구소에서 생물 학적 작은 각 중성자 뿌리기 악기는 생물 자료, 처리, 바이오 연료 및 바이오 영감 자료 취재를 나노미터의 수사에 전념 마이크로미터 길이 가늠 자. 막 단백질의 물리적 특성 (즉, 크기와 모양) 조사에 대 한 여기에 제시 된 방법 (여기, MmIAP, Methanoculleus marisnigri에서 intramembrane aspartyl 프로 테아 제) 솔루션 micelle을 형성의 세제는 다른 사람의 사이에서이 작은 각 중성자 뿌리기 악기에 대 한 잘 적합 한 다른 생물 특성화 기법 단백질 세제의 복잡 한 구조에 세제 기여를 해결 하기 위해 그들의 무 능력에 의해 방해 된다. 또한, 바이오 Deuteration 실험실에 대 한 액세스는 대규모 경작을 준비 하 고 표현 하는 중수소 표시 된 단백질 단백질에서 향상 된 산란 신호에 대 한 독특한 기능을 제공 합니다. 이 기술은 고해상도에서 구조 세부 정보를 제공 하지 않습니다, 막 단백질에 대 한 구조적 지식 격차 근처 원자 해상도 필요 없이 연구의 많은 주소 지정 가능 영역을 포함. 예를 들어이 지역 섭 동, 그리고 접는 펼쳐진 이벤트 동안 oligomeric 상태, 복잡 한 구조적 변경의 결정을 포함합니다. 이러한 조사는이 방법의 응용 프로그램을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.
막 단백질은 모든 유전자1 의 약된 30%에 의해 인코딩되고 현대의 약 약물에 대 한 대상의 강한 대다수를 나타냅니다. 2 이 단백질의 중요 한 세포 기능,3 하지만 그들의 풍요로 움과 중요성에도 불구 하 고 다양 한 수행-총 구조 연구 Collaboratory 구조 생물 정보학 (RCSB) 단백질에의 약 1%만 대표 데이터 은행입니다. 4 그들의 부분적으로 소수 성 특성으로 인해 막-바인딩 단백질의 구조 결정이 되었습니다 매우 도전. 5 , 6 , 7
많은 생물 기술, 측정을 위한 솔루션에 단 분산 입자를 요구 네이티브 막에서 막 단백질을 분리 하 고 기본 세포 막의 수용 성 모방에이 단백질 안정화 되었습니다 연구의 활성 영역에서 최근 수 십년입니다. 8 , 9 , 10 이러한 조사 이끌어 많은 소설 amphiphilic 어셈블리의 개발을 solubilize 막 단백질, nanodiscs,,1112,13 bicelles,14,15 등 및 amphipols. 16 , 그러나 17 , 세제 micelles 사용 하 여 주어진된 단백질의 가용성 요구 사항 만족을 위한 가장 일반적이 고 간단한 방법 중 하나 남아 있습니다. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 불행 하 게도, 아니 단일 세제 또는 세제의 마법의 혼합 현재 존재 만족 모든 막 단백질; 따라서, 이러한 조건 각 단백질의 고유한 요구 사항에 대 한 경험적으로 상영 될 해야 합니다. 26 , 27
세제는 솔루션 그들의 임계 micelle 농도 이상에서 micelles 이라는 형태로 집계 구조 자기 조립. Micelles (일반적으로 20-200에서 배열 하는) 많은 세제 단위체 micelle 코어 수성 용 매에 직면 micelle 쉘 계층에 배열 하는 친수성 머리 그룹을 형성 하는 소수 성의 알 킬 체인으로 구성 됩니다. 세제 및 micelle 형성의 동작 고전적인 찰스 Tanford의 소수 성 효과,28 및 크기에 의해 설명 하고있다 고 막 단백질 연구에 일반적으로 사용 되 세제에서 micelles의 모양 작은 각 뿌리기를 사용 하 여 특징. 29 , 30 세제 조직 막 단백질에 대 한 공부도 했다 고 깔끔한 세제 유사한 배열에서 단백질을 둘러싼 세제 분자와 단백질 세제 단지 (Pdc)의 형성 예상 micelles입니다. 31
하나 추가 세제를 사용 하 여 장점은 다른 세제를 통합 하 여 결과 micelle 속성을 조작할 수 있습니다. 많은 세제 전시 이상적인 혼합 하 고 혼합된 micelles의 선택 속성 구성 요소와 혼합의 비율에서 예측도 있습니다. 그러나 22 , 세제의 존재 수 여전히 도전을 제시 생물 characterizations 위한 전체 신호에 기여 함으로써. 예를 들어, x 선 및 산란 기법, PDC에 세제에서 신호 단백질에서 실제적으로 구별할 수 아니다. 32 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)와 조사 일반적으로 의존 갇혀 (냉동된) 입자; 단백질의 구조 정보는 여전히 특정 세제 또는 배경에 추가 세제의 높은 농도 의해 왜곡 됩니다. 33 (세제 포함) 전체 PDC 구조 해석으로 대체 방법 특정된 막 단백질 주위 세제를 재구성 하기 위해 노력 하는 계산 방법을 통해 되었습니다. 34
중성자 산란의 경우는 micelle에서 세제의 코어-쉘 배열 관찰된 산란에 기여 하는 폼 팩터를 생성 합니다. 다행히, 그들은 그물 관찰된 산란에 기여 하지 않는 그런 솔루션 구성 요소를 변경할 수 있습니다. 이 “일치 대조” 프로세스 산란 길이 조밀도 (버퍼) 배경의 일치를 달성 하기 위해 수소 중수소를 대체 하 여 이루어집니다. (사용 가능한 deuterated 대응)와 세제의 현명한 선택과 혼합의 그들의 비율을 고려 되어야 한다. 세제 micelles에 대 한 이러한 대체 deuterated 알 킬 체인 (d-h-꼬리 대신 꼬리) 하지만 같은 머리 그룹으로는 세제를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 세제는 잘 혼합, 이후35 그들의 집계 해야한다 가중치 두더지 분수 산란 길이 조밀도 두 가지 구성 요소 (h-꼬리와 d-꼬리)의 평균. 이 평균 대비 머리 그룹의 일치 때 유니폼 집계 구조 관찰된 산란에 모든 기여를 제거 하려면 완전히 일치할 수 있습니다.
선물이 여기 세제 micelles의 중성자 대비 화학적으로 동일한 세제 분자 중수소 라고 표시 된 알 킬 체인을 통합 하 여 조작 하는 프로토콜. 19 , 36 , 37 이 micelle 코어와 쉘, 중성자 산란의 고유 능력은 일치 하는 완전 한 동시 대비 수 있습니다. 35 , 38 이 상당히 세련 된 세부 수준 대비 일치 사용할 수 있습니다 그렇지 않으면 unfeasible 막 단백질 구조 연구. 또한,이 일치 하는 대비 접근 세제, 폴리머 교환 반응39 와 기름-물 dispersants,40 , bicelles,41 등 다른 solubilizing 에이전트 등 관련 된 다른 시스템을 확장할 수 있습니다. nanodiscs,42 또는 블록 공중 합체. 43 A 유사한 접근이이 원고, 하지만 알 킬 체인 또는 머리 그룹에 부분 중수소 대체와 단일 세제 종 채용 개요 최근에 출판 되었다. 37 이 수소와 중수소는 세제를 통해 임의의 분포를 개선 하기 위해 예상 될 수 있다 하는 동안 여기, 접근에 비해 대체 하 고 2 단계에 대 한 세제에 사용할 수 있는 위치 제한 수 합성 세제는 고려에 대 한 포즈 추가 과제를 필요합니다.
1 단계와 2 단계 아래 자주 상세한 프로토콜의 중복 때문에 초기 실험 계획 품질 제안서를 제출 할 수 있어야 합니다. 그러나 제안 제출으로 간주 하는, 중성자 실험 임박이 프로세스를 시작 해야 하는 것을 강조 하기 위해 첫 단계로 여기. 그것은 또한 제안에 의해 증명 한다, 필수 단계 중성자 연구에 대 한 필요성을 지 원하는 샘플의 생 화 학적 및 물리적 특성 (를 포함 하 여 순도 안정성)을가지고 하는 것입니다 주목 해야한다. 작은 각 중성자 산란 (SANS)에 대 한 일반적인 논의이 문서의 범위를 벗어납니다. 간단한 지만 철저 한 소개 Kaufmann,44 및 포괄적인 교과서에 초점 맞춘된 생물 작은 각도 솔루션 비 산 재료의 특성은 최근 게시 되었습니다 참조 작업에 제공 됩니다. 45 추가 권장된 독서 토론 섹션에서 제공 됩니다. 작은 각도 산란 산란 과정을 설명 하는 중앙 수량으로 소위 산란 벡터 Q를 사용 합니다. 이 문서 Q 널리 수용 되는 정의 사용 하 여 4π 죄악 (θ) = λ θ가 들어오고 흩어져 빔과 λ 사이의 절반 각도 옹스트롬의 중성자 방사선의 파장 /. 다른 정의 존재 사용 다른 기호 등의 ‘ 산란 벡터, 그리고 요인 2 π 또는 나노미터 Angstrom 대신를 사용 하 여 다 수 있습니다 ( 그림 10의 내용 참조).
구조 생물학 연구 솔루션 분산 솔루션에서 생체에서 생화학 및 구조 정보 (예: 전체 크기 및 모양)를 같은 보완 구조 기술을 활용 합니다. SAN은 낮은 해상도 막 단백질의 구조, 현대 구조 생물학 및 생화학의 핵심 초점을 결정 하기 위한 특히 매력적인 기술입니다. SAN의 순화 된 단백질 결정학 실험 (1 mg/샘플)의 비교를 요구 한다. 고 순도 deuterated 세제 관련 막 단백질 연구의 최근 확장 상업적인 가?…
The authors have nothing to disclose.
사무실의 생물학과 환경 연구 구조 분자 생물학 (CSMB) 및 바이오 ORNL의 센터에서 연구를 지원-과학적인 사용자 시설 부문, 기본적인 에너지 과학의 사무실, 미국에서 지 원하는 시설을 사용 하 여 SAN 에너지. 리버 먼 연구소에서 막 단백질에 구조 작업 NIH (DK091357, GM095638)에 의해 지원 되었습니다 및 NSF (0845445).
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator | EMD Millipore | UFC905096 | labware |
Ammonium citrate dibasic | Fisher Scientific | A663 | medium component |
Ammonium sulfate | EMD Millipore | 2150 | medium component |
Bioflo 310 Bioreactor System | Eppendorf | M1287-2110 | equipment |
Calcium chloride dihydrate | Acros | 423525000 | medium component |
Carbenicillin | IBI Scientific | IB02025 | antibiotic |
Chloramphenicol | EMD Millipore | 3130 | antibiotic |
Cobalt (II) chloride | Acros | AC21413-0050 | medium component |
Copper (II) sulfate | Acros | AC19771-1000 | medium component |
Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 756822 | medium component |
Drierite Gas Purifier | W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. | 27068 | |
EDTA, disodium, dihydrate | EMD Millipore | 4010 | medium component |
Emulsiflex-C3 | Avestin | EF-C3 | equipment |
Äkta Purifier UPC100 | GE Healthcare | equipment | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | medium component |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17116701 | |
Imidazole | VWR | 97064-622 | |
IPTG | Teknova | I3325 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | MP Biochemicals | ICN19404590 | medium component |
LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425-2 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-134 | medium component |
Manganese(II) sulfate monohydrate | Acros | AC20590-5000 | medium component |
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | equipment |
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310T | |
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310A | |
Potassium phosphate monobasic | VWR | 97062-346 | medium component |
RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific Sorvall | 46910 | equipment |
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free | Sigma-Aldrich | S8830 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | medium component |
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane | VWR | 28145-501 | labware |
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane | Thermo Scientific | 596-4520 | labware |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17517501 | |
Superose-12 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517301 | |
Ultrospec 10 Cell Density Meter | GE Healthcare | 80211630 | equipment |
Zinc sulfate monohydrate | Acros | AC38980-2500 | medium component |