Контраст соответствия моющего средства в малых угол нейтронного рассеяния экспериментов мембраной протеина структурного анализа и моделирования Ab Initio

Summary

Этот протокол демонстрирует как получить модель с низким разрешением ab initio и структурные детали моющих средств солюбилизирован мембранный белок в растворе с использованием малых угол нейтронного рассеяния с контраст подбор моющего средства.

Abstract

Биологических малого угол нейтронного рассеяния инструмент в высоких-Flux изотоп реактора из Oak Ridge национальной лаборатории предназначен для исследования биологических материалов, переработка биотоплива и био вдохновил материалы, охватывающие нанометр до Микрометр длина шкалы. Методы, представленные здесь для изучения физических свойств (например, размер и форма) мембранных белков (здесь, MmIAP, intramembrane аспартил протеазы от Methanoculleus marisnigri) в растворах формирования мицеллы являются моющих средств хорошо подходит для этого инструмента рассеяния нейтронов небольшой угол, среди других. Другие методы биофизические характеристики препятствуют их неспособность решить стиральный порошок взносы в сложной структуре белка-моющего средства. Кроме того доступ к био-Deuteration Lab предоставляет уникальные возможности для подготовки крупномасштабного культивирования и выражая дейтерия меченых белков для расширения рассеяние сигнала от белка. Хотя этот метод не предоставляет структурные детали в высоком разрешении, структурного разрыва для мембранных белков содержит много адресуемой области исследований не требуя вблизи атомных резолюции. Например эти области включают определение олигомерных государств, комплекс формирования, конформационные изменения во время возмущений и складные/разворачивающихся событий. Эти расследования может быть легко достигнуто путем применения этого метода.

Introduction

Мембранные белки кодируются с примерно 30% от всех генов¹ и представляют собой значительное большинство целей для современных лекарственных препаратов. ² эти белки выполняют множество жизненно важных клеточных функций,³ , но несмотря на обилие и важности — представляют только около 1% от общей структуры, депонируется в совместную исследований для протеина структурного биоинформатики (RCSB) Банк данных. ⁴ из-за их частично гидрофобная природа, структурные определения белков мембранных привязкой был чрезвычайно сложным. ^{5 , 6 , 7}

Как многие биофизические методы требуют монодисперсных частиц в растворе для измерения, изолируя мембранных белков из родной мембраны и стабилизации этих белков в растворимые мнемосхемы родной мембран был активной областью исследований в последние годы десятилетия. ^{8 , 9 , 10} эти исследования привели к разработке многих Роман амфифильных сборок солюбилизировать последнего мембранных белков, таких как nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 и amphipols. ^{16 , 17} однако, использование моющего средства мицеллы остается одним из наиболее распространенных и простой подходов для удовлетворения требований растворимость данного белка. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} к сожалению, нет единого моющего средства или Волшебная смесь моющих средств в настоящее время существует удовлетворяющего всех мембранных белков; Таким образом эти условия должны проверяться эпирически для уникальных потребностей каждого белка. ^{26 , 27}

Моющие средства самостоятельно собрать в растворе выше их концентрации мицеллообразования критической форме статистические структуры, называемые мицеллы. Мицеллы состоят из многих стиральный порошок мономеров (обычно начиная от 20-200) с гидрофобным алкил цепи, образуя ядром мицеллы и гидрофильные головы группы организованы в слое оболочки мицеллы, стоящих перед водного растворителя. Поведение моющих средств и формирования мицеллы классически был описан Чарльзом Tanford Гидрофобным эффектом,²⁸ и размеров и формы мицелл из часто используемых моющих средств в мембранных белков исследования были характеризуется, с помощью малых угол рассеяния. ^{29 , 30} моющего средства Организации о мембранных белков также были изучены, и образование комплексов протеина-моющее средство (PDC) ожидается молекулами моющего средства, окружающих белка в договоренность, которая напоминает аккуратно моющего средства Мицеллы. ³¹

Один добавил, что преимущество использования моющих средств, что результирующая мицеллы свойств может быть манипулирован включения других моющих средств. Многие моющие средства экспонат идеальное смешивание, и выберите пункт Свойства смешанные мицеллы даже может быть предсказано от компонентов и соотношение смешивания. ²² однако, присутствие моющего средства может по-прежнему создают проблемы для биофизические характеристики, способствуя общий сигнал. Например с рентгеновской и рассеяние света методы, сигнал от моющих средств в PDC практически неотличима от белка. ³² с одной частицы крио электронной микроскопии (крио ЭМ) расследования обычно полагаются на ловушку частицы (замороженных); структурные детали белка по-прежнему скрываются определенного моющих средств или высокой концентрации моющего средства, который добавляет к фону. ³³ альтернативные подходы к интерпретации полную структуру PDC (включая моющих средств) были сделаны через вычислительных методов, которые стремятся восстановить моющее вокруг данной мембранный белок. ³⁴

В случае рассеяния нейтронов ядро оболочка расположение моющего средства в мицеллы производит форм-фактор, который способствует наблюдаемых рассеяния. К счастью компоненты решения могут быть изменены таким образом, что они не способствуют чистой наблюдаемых рассеяния. Этот процесс «контраст соответствия» достигается путем замены дейтерия для водорода для достижения рассеяния длина плотности, что соответствует фона (буфер). Разумный выбор моющего средства (с доступных транс коллегами) и их соотношение смешивания должны рассматриваться. Для моющего средства мицеллы эта замена могут выполняться с использованием моющих средств с той же головы группы, но имеющие транс алкильной цепи (d хвост вместо h хвост). Так как моющие средства перемешанных,³⁵ их агрегатов будет иметь рассеяния длина плотности, что моль фракция взвешенный средний из двух компонентов (h хвосты и d хвосты). Когда этот контраст средней согласуется с этим глава группы, чтобы удалить все взносы в наблюдаемых рассеяния единообразные статистические структуры могут совпасть полностью.

Мы представляем здесь протокол манипулировать нейтронов контраст стиральный порошок мицелл, включив химически идентичны стиральный порошок молекул дейтерия меченых алкильной цепи. ^{19 , 36 , 37} это позволяет полный Одновременный контраст соответствия мицеллы ядро и оболочка, которая является уникальной возможностью рассеяния нейтронов. ^{35 , 38} с этим значительно изысканный уровнем детализации, контраст соответствия можно включить иначе неосуществимым исследования мембранных белков структур. Кроме того этот контраст соответствующий подход может быть распространен на другие системы, связанные с моющим средством, например полимер обмен реакции³⁹ и нефть вода диспергентов,⁴⁰ или даже другие solubilizing агентов, таких как bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² или блок сополимеры. Аналогичный подход ⁴³ A как указано в этой рукописи, но применение одного вида моющего средства с частичным дейтерия замен на алкильной цепи и/или руководитель группы, был недавно опубликован. ³⁷ в то время как это можно ожидать улучшения случайное распределение водорода и дейтерия во всем моющего средства по сравнению с подходом, представленные здесь, ограниченное количество доступных позиций на моющее средство для замещения и двухступенчатый стиральный порошок синтеза требуются создает дополнительные проблемы для рассмотрения.

Шаги 1 и 2 протокола подробно ниже часто перекрываются, так как начальный эксперимент планирование должно быть сделано представить предложение качества. Однако, считается представления предложений здесь как первый шаг, чтобы подчеркнуть, что этот процесс должен быть запущен задолго до начала эксперимента нейтронов. Следует также отметить, что необходимого шага, который должно быть подкреплено предложение, должен иметь биохимические и физические характеристики (в том числе чистоту и стабильности) образца, поддерживая необходимость нейтронных исследований. Общее обсуждение малых угол нейтронного рассеяния (SANS) выходит за рамки этой статьи. Краткий, но тщательное введение доступен в работе ссылка, которую Характеризация материалов Кауфман,⁴⁴ и всеобъемлющий учебник сосредоточена на биологических малых угол решение рассеяния недавно был опубликован. ⁴⁵ далее рекомендовал чтение приводится в разделе обсуждения. Малоуглового рассеяния использует так называемые рассеяния вектора Q в качестве центральной количество, которое описывает процесс рассеяния. Эта статья использует широко признанного определения Q = 4π sin (θ) / λ, где θ — половина угол между входящей и рассеянного пучка и λ является длина волны нейтронного излучения в ангстремы. Существуют другие определения, что использовать различные символы, такие как ‘ вектор рассеяния и что могут отличаться 2π фактор или с помощью нанометров вместо Ангстрем (см. также обсуждение рис. 10).

Protocol

1. подготовить и представить нейтрона фонда луч время и предложение инструмент Обратитесь к онлайн-ресурсы для выявления помещений рассеяния нейтронов, которые обеспечивают общего пользователя нейтрона луч время доступа, например Oak Ridge национальной лаборатории (ORNL). Карта нейтро…

Representative Results

Луч время и инструмент предложение должно четко передают всю информацию, необходимую для Комитета по обзору, таким образом, чтобы можно было произвести действительный оценку предлагаемого эксперимента. Связь с NSS настоятельно рекомендуется для неопытных пользовател…

Discussion

Структурная биология исследователи воспользоваться преимуществами дополнительных структурных методов как решение рассеяния для получения биохимических и структурных деталей (например, общий размер и форма) от биомолекул в растворе. SANS является особенно привлекательным техника для …

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component