Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

Summary

Este protocolo muestra cómo obtener un modelo de baja resolución ab initio y detalles estructurales de una proteína de membrana de detergente solubilizado en solución mediante dispersión de neutrones de ángulo pequeño con coincidencia de contraste del detergente.

Abstract

El instrumento de dispersión biológica small-angle neutron en el alto flujo isótopo Reactor de Oak Ridge National Laboratory se dedica a la investigación de materiales biológicos, biocombustible procesado y materiales Bioinspirados cubriendo nanómetro a escalas de la longitud del micrómetro. Los métodos presentados aquí para investigar las propiedades físicas (es decir, tamaño y forma) de proteínas de membrana (aquí, MmIAP, una intramembranosas aspartil proteasa de Methanoculleus marisnigri) en soluciones de formación de micelas son detergentes adecuado de este instrumento de dispersión de ángulo pequeño neutrón, entre otros. Otras técnicas de caracterización biofísica se ven obstaculizados por su incapacidad para abordar las contribuciones detergentes en una estructura compleja de proteína-detergente. Además, el acceso al laboratorio Bio-grado de deuteración ofrece capacidades únicas para la preparación de cultivos a gran escala y expresión de proteínas marcado con deuterio para mayor dispersión de la señal de la proteína. Mientras que esta técnica no proporciona los detalles estructurales en alta resolución, la brecha de conocimiento estructural de proteínas de la membrana contiene muchas zonas direccionables de investigación sin necesidad de resolución atómica cerca. Por ejemplo, estas áreas incluyen la determinación de los Estados, formación de complejos, cambios conformacionales durante la perturbación y eventos plegar/desplegar. Estas investigaciones se pueden lograr fácilmente a través de aplicaciones de este método.

Introduction

Proteínas de membrana están codificadas por aproximadamente el 30% de todos los genes¹ y representan una gran mayoría de objetivos de medicamentos modernos. ² estas proteínas realizan una amplia gama de funciones celulares vitales,³ pero a pesar de su abundancia e importancia — sólo representan alrededor del 1% de estructuras total depositado en la investigación Collaboratory para bioinformática estructural (RCSB) proteína Banco de datos. ⁴ debido a su naturaleza parcialmente hidrofóbica, determinación estructural de proteínas de membrana-limite ha sido sumamente difícil. ^{5 , 6 , 7}

Como muchas técnicas biofísicas requieren monodispersa partículas en solución para la medición, aislamiento de proteínas de la membrana de las membranas nativas y estabilización de estas proteínas en un imitador soluble de las membranas nativas ha sido un área activa de investigación en los últimos décadas. ^{8 , 9 , 10} estas investigaciones han llevado al desarrollo de muchas asambleas de novela anfifílicos para solubilizar proteínas de membrana, tales como nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 y amphipols. ^{16 , 17} sin embargo, el uso de micelas de detergente sigue siendo uno de los enfoques más comunes y sencillos para satisfacer los requisitos de la solubilidad de una proteína determinada. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} por desgracia, no solo detergente mágica mezcla de detergentes actualmente existe o que cumpla con todas las proteínas de la membrana; así, estas condiciones deben ser defendidas empíricamente para los requerimientos únicos de cada proteína. ^{26 , 27}

Detergentes uno mismo-montan en la solución por encima de su concentración micelar crítica para formar estructuras de agregados llamadas micelas. Micelas están compuestas de muchos monómeros detergentes (típicamente entre 20-200) con cadenas alkyl hidrofóbica formando un núcleo micelar e hidrofílicos grupos cabeza dispuestos en una capa de cáscara de micela hacia el disolvente acuoso. El comportamiento de la formación de la micela y los detergentes ha sido clásicamente descrito por Charles Tanford en El efecto hidrofóbico,²⁸ y tamaños y formas de micelas de los detergentes comúnmente usados en estudios de proteínas de membrana han sido caracteriza usando dispersión de ángulo pequeño. ^{29 , 30} organización de detergente sobre las proteínas de la membrana también se ha estudiado, y se espera la formación de complejos de proteína-detergente (PDC) con las moléculas de detergente que rodean la proteína en un arreglo que se asemeja al detergente limpio micelas. ³¹

Añade una ventaja en el uso de detergentes es que las propiedades resultantes de la micela pueden manipularse mediante la incorporación de otros detergentes. Muchos detergentes exhiben mezcla ideal, y seleccione Propiedades de micelas mixtas se pueden incluso predecir de los componentes y la relación de la mezcla. ²² sin embargo, la presencia de detergente puede todavía presentar desafíos para caracterizaciones biofísicas contribuyendo a la señal total. Por ejemplo, con rayos x y técnicas de dispersión de la luz, la señal de detergente en el PDC es prácticamente indistinguible de la proteína. ³² investigaciones con microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM) normalmente dependen de atrapadas partículas (congeladas); detalles estructurales de la proteína son todavía oscurecidos por ciertos detergentes o una alta concentración de detergente que se añade a un segundo plano. ³³ enfoques alternativos para interpretar la estructura PDC completa (incluyendo el detergente) se han hecho a través de métodos computacionales que pretenden reconstruir el detergente alrededor de una proteína de membrana dada. ³⁴

Para el caso de dispersión de neutrones, el arreglo de core-shell de detergente en la micela produce un factor de forma que contribuye a la dispersión observada. Afortunadamente, se pueden alterar componentes de la solución tal que no contribuyen a la dispersión observada neta. Este proceso de “coincidencia de contraste” se consigue sustituyendo el deuterio por hidrógeno alcanzar una densidad de longitud de dispersión que coincide con el del fondo (buffer). Deben considerarse una elección juiciosa del detergente (con contrapartes deuterados disponibles) y su proporción de la mezcla. De micelas de detergente, esta sustitución puede realizarse usando un detergente con el mismo grupo de cabeza pero con una cadena alquil deuterados (d-cola en lugar de h-cola). Puesto que los detergentes están bien mezclados,³⁵ los agregados tendrán una densidad de longitud de dispersión que es la fracción molar ponderada promedio de los dos componentes (h-colas y colas de d). Cuando este contraste promedio es consistente con el grupo de cabeza, las estructuras agregadas uniforme pueden combinarse completamente para quitar todas las contribuciones a la dispersión observada.

Presentamos aquí un protocolo para manipular el contraste de neutrón de micelas de detergente mediante la incorporación de moléculas detergentes químicamente idénticas con cadenas alkyl marcado con deuterio. ^{19 , 36 , 37} esto permite completo contraste simultáneo que empareja del núcleo micelar y la cáscara, que es una capacidad única de dispersión de neutrones. ^{35 , 38} este significativamente refinado nivel de detalle, coincidencia de contraste permiten lo contrario inviables estudios de estructuras de proteínas de membrana. Además, este enfoque de contraste de coincidencia se podría extender a otros sistemas con detergente, como intercambio de polímero reacciones³⁹ y aceite-agua dispersantes,⁴⁰ o incluso otros agentes solubilizantes, como bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² o bloque copolímeros. Enfoque similar ⁴³ A como se describe en este manuscrito, pero empleando una sola especie de detergente con sustituciones parciales del deuterio en el grupo alquil de cadena o cabeza, se publicó recientemente. ³⁷ mientras que esto puede ser para mejorar la distribución aleatoria de hidrógeno y deuterio en el detergente en comparación con el enfoque presentado aquí, el número limitado de posiciones disponibles en el detergente para sustitución y dos etapas síntesis de detergente necesaria plantea retos adicionales para su consideración.

Pasos 1 y 2 del protocolo que se detallan a continuación a menudo se superponen puesto que el experimento inicial planificación debe hacerse para presentar una propuesta de calidad. Sin embargo, la presentación de propuesta se considera aquí como el primer paso para destacar que este proceso debe comenzar antes de un experimento de neutrones. Cabe señalar que un paso necesario, que debe ser demostrado por la propuesta, es que la caracterización bioquímica y física (incluyendo la pureza y estabilidad) de la muestra apoya la necesidad de estudios de neutrones. Una discusión general de ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) está fuera del alcance de este artículo. Una introducción breve pero exhaustiva está disponible en la obra de referencia de Caracterización de materiales por Kaufmann,⁴⁴ y una solución integral de libros de texto enfocada en biológico ángulo pequeño dispersión ha sido publicado recientemente. ⁴⁵ más lectura recomendada es dada en la sección de discusión. Dispersión de ángulo pequeño utiliza el llamado vector de dispersión Q como la cantidad central que describe el proceso de dispersión. Este artículo utiliza la definición ampliamente aceptada Q = 4π pecado (θ) / λ, donde θ es la mitad el ángulo entre la viga entrante y dispersa y λ es la longitud de onda de la radiación de neutrón en Angstroms. Existen otras definiciones que uso diferentes símbolos tales como ‘ por el vector de dispersión y que puede variar por un factor 2π o mediante nanómetros en lugar de Angstrom (véase también discusión de la figura 10).

Protocol

1. preparar y presentar una propuesta de instrumento y neutrones instalación haz tiempo Consultar recursos en línea para identificar servicios de dispersión de neutrones que acceso usuario general neutrón viga tiempo, como laboratorio nacional de Oak Ridge (ORNL). Mapa de neutrón instalaciones e información sobre la investigación del neutrón en todo el mundo está disponible en línea. 46 ten en cuenta que estas instalaciones tienen convocatorias periódicas de propuestas; determ…

Representative Results

Una propuesta de instrumento y tiempo de viga debe transmitir claramente toda la información necesaria al Comité de revisión para que se puede hacer una evaluación válida del experimento propuesto. Comunicación con un NSS es altamente sugerido para usuarios inexpertos. El SNA puede evaluar viabilidad inicial y presentación de propuesta de guía para enfatizar el potencial para la ciencia de alto impacto, viabilidad y seguridad. La información proporcionada en la propuesta debe inc…

Discussion

Investigadores de biología estructural, aprovechando técnicas estructurales complementarias como dispersión de la solución para obtener los datos bioquímicos y estructurales (tales como tamaño y forma) de biomoléculas en solución. SANS es una técnica particularmente atractiva para determinar estructuras de proteínas de membrana de baja resolución, un centro de atención de la moderna biología estructural y bioquímica. SANS requiere cantidades de proteínas purificadas comparables a las de los ensayos cristal…

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component