Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

Summary

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Abstract

O instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico no alto fluxo Isotope Reactor de Oak Ridge National Laboratory dedica-se à investigação de materiais biológicos, processamento de biocombustíveis e materiais bio-inspirado cobrindo nanômetros para escalas de comprimento do micrômetro. Os métodos apresentados aqui para investigar propriedades físicas (ou seja, o tamanho e forma) de proteínas de membrana (aqui, MmIAP, um intramembrane aspartil protease de Methanoculleus marisnigri) em soluções de formação de micela detergentes são well-suited para este instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo, entre outros. Outras técnicas de caracterização biofísica são prejudicadas por sua incapacidade de abordar as contribuições de detergente em uma estrutura complexa de proteína-detergente. Além disso, o acesso ao laboratório de Bio-Deuteration fornece recursos exclusivos para a preparação de cultivos em grande escala e expressando proteínas deutério-labeled pelo sinal de maior dispersão da proteína. Enquanto esta técnica não fornece detalhes estruturais em alta resolução, a lacuna de conhecimento estrutural para proteínas de membrana contém muitas áreas endereçáveis de pesquisa sem a necessidade de resolução atômica perto. Por exemplo, estas áreas incluem a determinação dos Estados oligoméricos, a formação do complexo, a mudanças conformacionais durante a perturbação e eventos de dobradura/revelação. Estas investigações podem ser facilmente realizadas através de aplicações deste método.

Introduction

Proteínas da membrana são codificadas por um estimado de 30% de todos os genes¹ e representam uma forte maioria de alvos para drogas medicinais modernos. ² estas proteínas executam uma grande variedade de funções celulares vitais,³ mas apesar da sua abundância e importância — representam apenas cerca de 1% do totais estruturas depositados na organização da pesquisa para proteína de Bioinformática estrutural (RCSB) Banco de dados. ⁴ devido à sua natureza parcialmente hidrofóbica, determinação estrutural de proteínas de membrana-limite tem sido extremamente desafiador. ^{5 , 6 , 7}

Como muitas técnicas biofísicas exigem monodisperso partículas em solução para medição, isolando as proteínas de membrana de membranas nativas e estabilizar estas proteínas em um mímico solúvel das membranas nativas tem sido uma área ativa de pesquisa em recentes décadas. ^{8 , 9 , 10} estas investigações levaram ao desenvolvimento de muitos conjuntos de romance anfifílica para solubilizar as proteínas de membrana, tais como nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 e amphipols. ^{16 , 17} no entanto, o uso de detergentes micelas continua a ser uma das abordagens mais comuns e simples para satisfazer os requisitos de solubilidade de uma determinada proteína. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} -infelizmente, nenhum único detergente ou mistura mágica de detergentes existe atualmente que satisfaça todas as proteínas de membrana; assim, estas condições devem ser empiricamente selecionadas para os requisitos exclusivos de cada proteína. ^{26 , 27}

Detergentes auto-montagem na solução acima da concentração crítica micelle para formar estruturas agregadas chamadas micelas. Micelas são compostas de muitos monômeros detergentes (normalmente variando de 20-200) com cadeias alquila hidrofóbicas, formando um núcleo micelle e grupos cabeça hidrofílicos, dispostos em uma camada de casca micelle enfrentando o solvente aquoso. O comportamento de detergentes e formação micela foi classicamente descrito por Charles Tanford em O efeito hidrofóbico,²⁸ e tamanhos e formas das micelas de detergentes usados em estudos de proteínas de membrana têm sido caracteriza-se usando o pequeno ângulo espalhamento. ^{29 , 30} organização de detergente sobre as proteínas de membrana também tem sido estudada, e a formação de complexos proteína-detergente (PDCs) é esperada com moléculas de detergente em torno da proteína em um arranjo que se assemelha o detergente puro micelas. ³¹

Um adicionado a vantagem em usar detergentes é que as propriedades de micela resultante podem ser manipuladas, incorporando outros detergentes. Muitos detergentes exibem uma mistura ideal, e selecione Propriedades de micelas mistas nem podem ser previstas a partir os componentes e a proporção de mistura. ²² no entanto, a presença de detergente pode ainda apresentar desafios para caracterizações biofísicos, contribuindo para o sinal global. Por exemplo, com raio-x e técnicas de espalhamento de luz, sinal de detergente no PDC é praticamente indistinguível da proteína. ³² investigações com single-particle cryo-microscopia (cryo-EM) normalmente contam com partículas (congeladas) presas; detalhes estruturais da proteína ainda são obscurecidos por determinados detergentes ou uma alta concentração de detergente, que acrescenta ao fundo. ³³ abordagens alternativas para interpretar a estrutura completa do PDC (incluindo o detergente) foram feitas através de métodos computacionais que visam reconstruir o detergente em torno de uma proteína de membrana determinado. ³⁴

Para o caso de dispersão de nêutrons, o arranjo de núcleo-casca de detergente no micelle produz um fator de forma que contribui para a dispersão observada. Felizmente, componentes de solução podem ser alterados, tal que eles não contribuem para a dispersão líquida observada. Este processo de “correspondência de contraste” é conseguido pela substituição de deutério de hidrogênio obter uma densidade de comprimento de dispersão que corresponde do fundo (tampão). Uma escolha criteriosa de detergente (com contrapartes deuterados disponíveis) e sua proporção de mistura devem ser considerados. Para detergentes micelas, essa substituição pode ser realizada usando um detergente com o mesmo grupo de cabeça mas tendo uma cadeia deuterado (d-cauda em vez de h-cauda). Uma vez que os detergentes são bem misturados,³⁵ seus agregados terá uma densidade de comprimento de dispersão que é a fração molar-ponderada média dos dois componentes (h-caudas e d-caudas). Quando este contraste médio é consistente com a do grupo principal, as estruturas de agregação uniformes podem ser correspondidas totalmente para remover todas as contribuições para dispersão observada.

Apresentamos aqui um protocolo para manipular o contraste de nêutrons de micelas detergentes pela incorporação de moléculas de detergente quimicamente idênticas com cadeias alquila deutério-rotulados. ^{19 , 36 , 37} isto permite completo contraste simultâneo de correspondência do micelle núcleo e casca, que é um recurso exclusivo de dispersão de nêutrons. ^{35 , 38} com este significativamente refinado nível de detalhe, correspondência de contraste pode habilitar caso contrário inviáveis estudos de estruturas de proteínas de membrana. Além disso, esta abordagem de correspondência de contraste pode ser estendida para outros sistemas que envolvem detergente, como polímero troca reações dispersantes óleo-água e³⁹ ,⁴⁰ ou até mesmo outros agentes solubilizante, tais como bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² ou bloco de copolímeros. ⁴³ A abordagem semelhante como descrito neste manuscrito, mas empregando uma única espécie de detergente com substituições de deutério parcial sobre o grupo alquila de cadeia e/ou cabeça, foi recentemente publicada. ³⁷ enquanto isso pode ser esperado para melhorar a distribuição aleatória de hidrogênio e deutério em todo o detergente em comparação com a abordagem apresentada aqui, o número limitado de posições disponíveis sobre o detergente para substituição e em duas etapas síntese de detergente necessário coloca desafios adicionais para a consideração.

As etapas 1 e 2 do Protocolo detalhado abaixo muitas vezes sobrepõem-se desde o planejamento do experimento inicial deve ser feito para apresentar uma proposta de qualidade. No entanto, a apresentação de proposta é considerada aqui como o primeiro passo para enfatizar que esse processo deve ser iniciado bem antes de um experimento de nêutrons. Também deve ser notado que um passo pré-requisito, que deve ser demonstrado pela proposta, é a caracterização bioquímica e física (incluindo pureza e estabilidade) da amostra apoiando a necessidade de estudos de nêutrons. Uma discussão geral do ângulo pequeno neutrão espalhamento (SANS) está além do escopo deste artigo. Uma introdução breve, mas completa está disponível na obra de referência, Caracterização de materiais por Kaufmann,⁴⁴ e uma abrangente livro focado em pequeno ângulo solução biológica dispersando recentemente tem sido publicado. ⁴⁵ -mais leitura recomendada é dado na seção de discussão. Dispersão de ângulo pequeno usa o vetor de dispersão chamado Q como a quantidade de central que descreve o processo de espalhamento. Este artigo usa a definição amplamente aceita Q = 4π sin (θ) / λ, onde θ é meio o ângulo entre o feixe de entrada e dispersado e λ é o comprimento de onda da radiação de nêutron em Angstroms. Outras definições existem que uso diferentes símbolos tais como está ‘ para o vetor de dispersão e que podem diferir por um fator 2 π ou usando nanômetros no lugar de Angstrom (Veja também a discussão da Figura 10).

Protocol

1. preparar e apresentar um nêutron instalação feixe tempo e proposta de instrumento Consulte os recursos online para identificar instalações de dispersão de nêutrons que fornecem acessar de tempo de feixe de nêutrons usuário geral, como Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mapa de nêutrons facilidades e informações sobre pesquisa de nêutrons em todo o mundo está disponível online. 46 estar ciente de que estas instalações têm tipicamente regulares convites à apresenta…

Representative Results

Uma proposta de tempo e instrumento de feixe claramente deve transmitir todas as informações necessárias para o Comitê de revisão para que uma avaliação válida do experimento proposto pode ser feita. Comunicação com um NSS é altamente recomendada para usuários inexperientes. O NSS podem avaliar a viabilidade inicial e apresentação de proposta de guia para enfatizar o potencial para a ciência de alto impacto, segurança e viabilidade. As informações fornecidas na proposta …

Discussion

Pesquisadores de biologia estrutural aproveitam técnicas estruturais complementares como espalhamento da solução para obter detalhes bioquímicos e estruturais (como forma e tamanho total) de biomoléculas em solução. SANS é uma técnica particularmente atraente para a determinação de estruturas de baixa resolução de proteínas de membrana, um foco central de Bioquímica e biologia estrutural moderna. SANS requer quantidades de proteínas purified comparáveis dos ensaios cristalográficos (1 mg/amostra). A dis…

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component