Questo protocollo viene illustrato come ottenere un modello a bassa risoluzione ab-initio e dettagli strutturali di una proteina di membrana detergente-solubilizzato in soluzione mediante scattering di neutroni piccolo angolo con contrasto-corrispondenza del detergente.
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Articolo metodologico
Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo strumento di dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone al High-Flux isotopo reattore di Oak Ridge National Laboratory è dedicato allo studio di materiali biologici, biocarburanti lavorazione e materiali bio-ispirato che coprono nanometro a scale di lunghezza di micrometro. I metodi presentati qui per indagare le proprietà fisiche (cioè, dimensioni e forma) delle proteine di membrana (qui, MmIAP, del intramembrane aspartil proteasi da Methanoculleus marisnigri) in soluzioni di formazione di micelle sono detergenti particolarmente adatto per questo strumento di scattering ad angolo piccolo neutrone, tra gli altri. Altre tecniche di caratterizzazione biofisica sono ostacolati dalla loro incapacità di affrontare i contributi detersivi in una struttura di complesso proteina-detergente. Accesso al laboratorio di Bio-Deuteration fornisce inoltre funzionalità uniche per la preparazione di coltivazioni su larga scala e che esprimono le proteine deuterio-etichettati per una maggiore dispersione del segnale dalla proteina. Mentre questa tecnica non fornisce dettagli strutturali in alta risoluzione, il divario di conoscenza strutturale per le proteine di membrana contiene molte zone indirizzabile di ricerca senza risoluzione vicino-atomica. Ad esempio, queste aree includono la determinazione degli Stati oligomerici, formazione complessa, cambiamenti conformazionali durante perturbazione ed eventi di chiusura/apertura. Queste indagini possono essere facilmente realizzate attraverso applicazioni di questo metodo.
Introduzione
Proteine di membrana sono codificati di circa il 30% di tutti i geni1 e rappresentano una forte maggioranza di bersagli per farmaci medicinali moderni. 2 queste proteine svolgono una vasta gamma di funzioni cellulari vitali,3 ma nonostante la loro abbondanza e importanza — rappresentano solo circa l'1% del totale strutture depositato nel Research Collaboratory per bioinformatica strutturale (RCSB) proteina Banca dati. 4 a causa della loro natura parzialmente idrofobo, determinazione strutturale delle proteine di membrana-limita è stato estremamente impegnativo.
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Protocollo
1. preparare e presentare una proposta di strumento e tempo fascio di neutroni Facility
- Consultare le risorse online per l'identificazione di strutture di scattering di neutroni che forniscono l'accesso di utente generale neutroni fascio tempo, come ad esempio Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mappa di neutroni strutture e informazioni sulla ricerca di neutroni in tutto il mondo è disponibile online. 46 essere consapevoli del fatto che queste strutture sono in genere regolari inviti a presentare proposte; Questo determina quando sarà disponibile la prossima volta di larghezza. Neutroni sono utilizzati per una varietà di applicazio....
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Risultati
Una proposta di tempo e strumento di fascio chiaramente dovrebbe trasmettere tutte le informazioni necessarie per il Comitato di revisione in modo che può essere fatta una valutazione valida dell'esperimento proposto. Comunicazione con un NSS è altamente consigliata per gli utenti inesperti. il NSS può valutare fattibilità iniziale e presentazione delle proposte Guida per enfatizzare la fattibilità, la sicurezza e il potenziale per la scienza ad alto impatto. Le informazioni fornite nella.......
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Discussione
I ricercatori di biologia strutturale sfruttano tecniche strutturali complementari come soluzione dispersione per ottenere dettagli biochimici e strutturali (ad esempio, forma e dimensioni complessive) da biomolecole in soluzione. SANS è una tecnica particolarmente attraente per la determinazione di strutture di bassa risoluzione delle proteine di membrana, un focus di nucleo della moderna biologia strutturale e biochimica. SANS richiede quantità di proteine purificate paragonabili a quelli degli studi cristallografici (.......
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Dichiarazioni
Gli autori Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver sono contratte attraverso UT-Battelle con noi DOE per sostenere il programma utente di neutroni scienza e Bio-SANS strumento all'Oak Ridge National Laboratory, utilizzato in questo articolo.
Questo manoscritto è stato co-autore di UT-Battelle, LLC, sotto contratto DE-AC05-00OR22725 con l'US Department of Energy (DOE). Mantiene il governo degli Stati Uniti e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, in tutto il mondo per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di questo manoscritto o consentire gli altri a farlo, fini governo US. DOE fornirà accesso del pubblico a questi risultati di ricerca sponsorizzato dal governo federale conformemente al piano di accesso pubblico DOE. 82
Ringraziamenti
L'ufficio di biologico e la ricerca ambientale sostenuto la ricerca di ORNL centro per biologia molecolare strutturale (CSMB) e Bio-SANS utilizzando strutture supportati dalla divisione scientifica di strutture utente, Office di base energia scienze, dipartimento di di energia. Opere strutturali su proteine di membrana nel laboratorio di Lieberman sono stata sostenuta da NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Concentratore Amicon Ultra MWCO 50KDa | EMD Millipore | UFC905096 | da laboratorio |
| Acido citrato di ammonio bibasico | Fisher Scientific | A663 | componente medio |
| Solfato di ammonio | EMD Millipore | 2150 | componente medio |
| Bioflo 310 Sistema di bioreattori | Eppendorf | M1287-2110 | |
| attrezzatura Cloruro di calcio diidrato | Acros | 423525000 | componente medio |
| Carbenicillina | IBI Scientific | IB02025 | antibiotico |
| Cloramfenicolo | EMD Millipore | 3130 | antibiotico |
| Cloruro di cobalto (II) | Acros | AC21413-0050 | componente medio |
| Solfato di rame (II) | Acros | AC19771-1000 | componente medio |
| Ossido di deuterio | Sigma-Aldrich | 756822 | componente medio |
| Drierite Gas Purifier | W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. | 27068 | |
| EDTA, disdio, diidrato | EMD Millipore | 4010 | componente medio |
| Emulsiflex-C3 | Avestin | EF-C3 | apparecchiature |
| Ä kta Purificatore UPC100 | GE Healthcare | attrezzatura | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | componente medio |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR colonna | GE Healthcare | ||
| Imidazolo | VWR | 97064-622 | |
| IPTG | Teknova | I3325 | |
| Cloruro di ferro (III) esaidrato | MP Biochemicals | ICN19404590 | componente medio |
| LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425-2 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato | VWR | 97062-134 | componente medio |
| Solfato di manganese (II) monoidrato | Acros | AC20590-5000 | componente medio |
| MaxQ 6000 Agitatore incubato/refrigerato | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | attrezzatura |
| n-Dodecil-d25-β-D-maltopiranoside | Anatrace | D310T | |
| n-Dodecil-β-D-maltopiranoside | Anatrace | D310A | |
| Fosfato di potassio monobasico | VWR | 97062-346 | componente medio |
| RC 6 Plus Centrifuga | Thermo Scientific Sorvall | 46910 | attrezzatura |
| SIGMAFAST inibitore della proteasi compresse cocktail, Senza EDTA | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Sigma-Aldrich | S7907 | componente medio |
| Filtro per siringa sterile da 25 mm con 0,2µ m Membrana PES | VWR | 28145-501 | |
| Filtro sterile monouso per flacone con 0,2µ m membrana in PES | Thermo Scientific | 596-4520 | Articoli da laboratorio |
| Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | ||
| Colonna Superose-12 10/300 GL | GE Healthcare | ||
| Densimetro cellulare Ultrospec 10 | GE Healthcare | 80211630 | attrezzature |
| Solfato di zinco monoidrato | Acros | AC38980-2500 | componente medio |
Riferimenti
- Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
- Tautermann, C. S. GPCR struc....
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Ristampe e permessi
