Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Summary

Dit protocol laat zien hoe een model met een lage resolutie ab initio en structurele details van een wasmiddel-ontbindend membraan eiwit in small-angle neutron scattering met contrast-matching van het detergent oplossing te verkrijgen.

Abstract

De biologische small-angle neutron scattering instrument bij de High-Flux isotoop Reactor van Oak Ridge National Laboratory is gewijd aan het onderzoek van biologische materialen, verwerking biobrandstoffen en bio-geïnspireerde materialen ter bekleding van nanometer te micrometer lengte schalen. De methoden die hier gepresenteerd voor het onderzoek van de fysische eigenschappen (dat wil zeggen, de grootte en vorm) van membraaneiwitten (hier, MmIAP, een intramembrane aspartyl protease vanaf Methanoculleus marisnigri) in oplossingen van micel-vormende wasmiddelen zijn zeer geschikt voor deze small-angle neutron scattering instrument, onder anderen. Andere biofysische karakterisering technieken worden belemmerd door hun onvermogen om aan te pakken van het wasmiddel bijdragen in een complexe structuur van de proteïne-wasmiddel. Daarnaast biedt toegang tot de Bio-Deuteration Lab unieke mogelijkheden voor de voorbereiding van grootschalige teelten en uiten van deuterium-geëtiketteerden eiwitten voor verbeterde verstrooiing signaal van het eiwit. Terwijl dit techniek biedt geen structurele details in hoge resolutie, de structurele kenniskloof voor membraaneiwitten bevat vele adresseerbare onderzoeksgebieden zonder in de buurt van de atomaire resolutie. Bijvoorbeeld, deze gebieden bepaling van oligomere Staten, complexvorming, conformationele wijzigingen tijdens perturbation, en vouwen/ontvouwen evenementen te omvatten. Deze onderzoeken kunnen gemakkelijk worden bereikt door de toepassingen van deze methode.

Introduction

Membraaneiwitten worden gecodeerd door een naar schatting 30% van alle genen¹ en vertegenwoordigen een grote meerderheid van de doelen voor de moderne geneesmiddelen. ² deze eiwitten voeren een breed scala van vitale cellulaire functies,³ maar ondanks hun overvloed en belang — vertegenwoordigen slechts ongeveer 1% van de totale structuren die zijn neergelegd in de voor structurele Bioinformatics (RCSB) eiwit Collaboratory onderzoek Gegevens Bank. ⁴ vanwege hun gedeeltelijk hydrofobe aard, structurele bepaling van membraan-gebonden eiwitten is buitengewoon uitdagende. ^{5 , 6 , 7}

Zoals vele biofysische technieken monodispers deeltjes in oplossing voor meting vereisen, isoleren van membraaneiwitten van inheemse membranen en het stabiliseren van deze eiwitten in een oplosbare nabootsen van de inheemse membranen geweest een actief gebied van het onderzoek in de afgelopen decennia. ^{8 , 9 , 10} deze onderzoeken hebben geleid tot de ontwikkeling van vele nieuwe amfifiele samenstellingen aan membraaneiwitten, zoals nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^{14,15 solubilize} en amphipols. ^{16 , 17} het gebruik van detergenten micellen blijft echter een van de meest voorkomende en eenvoudige manieren om te voldoen aan de eisen van de oplosbaarheid van een bepaald eiwit. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} helaas geen enkele wasmiddel of magische mengsel van detergentia momenteel bestaat die voldoet aan alle membraaneiwitten; Dus, deze voorwaarden moeten empirisch worden gescreend voor de unieke vereisten van elke proteïne. ^{26 , 27}

Detergentia monteren zelf in oplossing boven hun kritische micel concentratie aan statistische structuren vorm genaamd micellen. Micellen zijn samengesteld uit vele wasmiddel monomeren (meestal variërend van 20-200) met hydrofobe alkyl-ketens vormen een micel kern en hydrofiele kop groepen gerangschikt in een micel shell laag geconfronteerd met de waterige oplosmiddelen. Het gedrag van detergentia en micel vorming is klassiek beschreven door Charles Tanford in The hydrofobe Effect,²⁸ en maten en vormen van micellen van veelgebruikte detergentia in membraan eiwit studies zijn gekenmerkt met behulp van kleine-hoek verstrooiing. ^{29 , 30} wasmiddel organisatie over membraaneiwitten is ook onderzocht, en de vorming van eiwit-wasmiddel complexen (PDC’s) met wasmiddel moleculen rond het eiwit in een rangschikking die lijkt op het keurige wasmiddel wordt verwacht micellen. ³¹

Een toegevoegd voordeel bij het gebruik van detergentia is dat de resulterende micel eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd door de integratie van andere detergentia. Veel detergenten vertonen ideale mengen, en selecteer Eigenschappen van gemengde micellen kunnen zelfs worden voorspeld op grond van de onderdelen en de verhouding van het mengen. ²² echter de aanwezigheid van wasmiddel kan nog presenteren uitdagingen voor biofysische karakterisaties door bij te dragen aan de algehele signaal. Bijvoorbeeld met x-stralen en lichtverstrooiing technieken is signaal van wasmiddel in de PDC vrijwel niet te onderscheiden van eiwit. ³² onderzoeken met single-deeltje cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) meestal rekenen op gevangen (bevroren) deeltjes; structurele details van het eiwit zijn nog steeds verduisterd door bepaalde wasmiddelen of een hoge concentratie van wasmiddel die wordt toegevoegd aan de achtergrond. ³³ alternatieve benaderingen naar het interpreteren van de volledige structuur van de PDC (met inbegrip van het wasmiddel) zijn aangebracht door middel van computationele methoden die willen reconstrueren het wasmiddel rond een bepaald membraan eiwit. ³⁴

Voor het geval van neutronen verstrooiing produceert de rangschikking van de kern-shell van wasmiddel in de micel een form-factor die tot de waargenomen verstrooiing bijdraagt. Gelukkig, kunnen oplossing onderdelen worden gewijzigd, zodat ze niet aan de netto waargenomen verstrooiing bijdragen. Dit proces van “contrast overeenkomende” wordt bereikt door het vervangen van deuterium voor waterstof te bereiken een verstrooiing lengte dichtheid die overeenkomt met de achtergrond (buffer). Een verstandige keuze van wasmiddel (met beschikbare Halfzwaar tegenhangers) en hun verhouding van mengen moeten worden beschouwd. Voor detergentia micellen, kan deze vervanging worden uitgevoerd met een sopje met dezelfde hoofd groep maar met een Halfzwaar alkylketen (d-staart in plaats van h-staart). Aangezien de detergentia goed gemengd zijn,³⁵ hun aggregaten zal een soortelijke massa hebben verstrooiing lengte die is de mol-fractie gewogen gemiddelde van de twee componenten (h vliegengordijn en d vliegengordijn). Wanneer dit gemiddelde contrast consistent met die van de hoofd groep is, kunnen de uniforme statistische structuren gekoppeld worden volledig als u wilt verwijderen van alle bijdragen aan waargenomen verstrooiing.

Wij presenteren hier een protocol om te manipuleren het neutron contrast van wasmiddel micellen door integratie van chemisch identiek wasmiddel moleculen met deuterium-geëtiketteerden alkyl ketens. ^{19 , 36 , 37} dit toestaat volledige gelijktijdige contrast matching van micel kern en shell, dat een unieke mogelijkheid van neutronen verstrooiing is. ^{35 , 38} met deze aanzienlijk verfijnd detailniveau, contrast bijpassende kunnen anders onhaalbaar studies van membraan eiwit structuren. Bovendien, kan deze contrast-matching aanpak worden uitgebreid naar andere systemen waarbij wasmiddel, zoals polymeer uitwisseling reacties³⁹ en olie-water dispergeermiddelen,⁴⁰ of zelfs andere solubilizing agenten, zoals bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² of blok copolymeren. ⁴³ A vergelijkbare aanpak zoals omschreven in dit manuscript, maar het tewerkstellen van een enkele wasmiddel soorten met gedeeltelijke deuterium substituties op de alkyl-keten en/of hoofd-groep, werd onlangs gepubliceerd. ³⁷ terwijl dit verwacht kan worden dat de willekeurige verdeling van waterstof en deuterium gedurende het wasmiddel verbeteren ten opzichte van de hier gepresenteerde benadering het beperkte aantal beschikbare posities over het wasmiddel voor vervanging en in twee stappen wasmiddel synthese vereist poses extra uitdagingen voor behandeling.

Stap 1 en 2 van het protocol hieronder vaak overlappen omdat eerste experiment plannen gebeuren moet een kwaliteit wijzigingsvoorstel in te dienen. Indiening van het voorstel is echter hier als de eerste stap om te benadrukken dat dit proces ruim van tevoren een neutron experiment moet worden gestart. Ook opgemerkt moet worden dat een vereiste stap, die moet worden aangetoond door het voorstel, is dat de biochemische en fysische karakterisering (met inbegrip van de zuiverheid en stabiliteit) van het monster ter ondersteuning van de noodzaak van studies van de neutron. Een algemene discussie van small-angle neutron verstrooiing (SANS) valt buiten het bestek van dit artikel. Een korte maar grondige inleiding is beschikbaar in het referentiewerk Karakterisering van materialen door Kaufmann,⁴⁴ en een leerboek gericht op biologische kleine-hoek totaaloplossing verstrooiing is onlangs verschenen. ⁴⁵ meer aanbevolen lectuur wordt verwezen in de sectie discussie. Kleine hoek verstrooiing gebruikt de zogenaamde verstrooiing vector Q als het centrale aantal dat het proces van de verstrooiing beschrijft. Dit artikel maakt gebruik van de algemeen aanvaarde definitie Q = 4π zonde (θ) / λ, waar θ de helft van de hoek tussen inkomende en verspreide lichtbundel en λ is de golflengte van de neutronenstraling in Angstroms is. Andere definities bestaan dat gebruik verschillende symbolen zoals de ‘ voor de verstrooiing vector, en die verschillen kunnen met een factor 2π of met behulp van nanometer in plaats van Angstrom (Zie ook bespreking van Figuur 10).

Protocol

1. voorbereiding en indiening van een Neutron faciliteit Beam tijd en een Instrument voorstel Raadpleeg online bronnen voor het identificeren van neutronen verstrooiing voorzieningen waarmee algemene neutron lichtbundel tijd gebruikerstoegang, zoals Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Een kaart van neutron faciliteiten en informatie over neutron onderzoek wereldwijd is online beschikbaar. 46 worden zich ervan bewust dat deze voorzieningen meestal regelmatig oproepen tot voorstellen; Hi…

Representative Results

Een lichtbundel tijd en instrument voorstel moet duidelijk overbrengen van alle informatie die nodig is aan de Commissie ter beoordeling zodat een geldige van de voorgestelde experiment kunnen worden beoordeeld. Communicatie met een NSS is zeer aanbevolen voor onervaren gebruikers. De NSS kan beoordelen eerste haalbaarheid en gids voorstel indienen om te benadrukken van de haalbaarheid, veiligheid en het potentieel voor hoge impact wetenschap. De informatie in het voorstel moet bevatten a…

Discussion

Structurele biologie onderzoekers profiteren van aanvullende structurele technieken zoals oplossing verstrooiing verkrijgen van biochemische en structurele informatie (zoals de totale omvang en vorm) van biomoleculen in oplossing. SANS is een bijzonder aantrekkelijk techniek voor het bepalen van de lage resolutie structuren van membraaneiwitten, een kern focus van moderne structurele biologie en biochemie. SANS vereist hoeveelheden van gezuiverde eiwitten die vergelijkbaar zijn met die van kristallografische proeven (1 m…

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component