Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.
Proteínas in vivo, a menudo forman parte de grandes complejos macromoleculares donde dinámica y especificidad de unión al final dicta salidas funcionales. En este trabajo, la toxina del ántrax pre-endosomal es montada y la transición en el complejo endosomal. En primer lugar, el dominio N-terminal de un factor letal mutante de cisteína (LFN) se une a un biosensor de interferometría (BLI) de biocapa por disulfuro de acoplamiento en una orientación óptima, permitiendo prepore antígeno protector (PA) enlazar (Kd 1 nM). La LFN-PA óptimo orientadoprepore complejo entonces se une a soluble capilar morfogénico Gen-2 (CMG2) receptor de superficie celular (Kd 170 pM), resultando en un complejo de pre-endosomal ántrax representativo, estable a pH 7,5. Este complejo montado después es sometida a representante de acidificación (pH 5.0) del último endosome entorno a la PAprepore la transición en el estado de poro de membrana insertada. Este estado deporo PA da lugar a un enlace débil entre el receptor CMG2 y la LFN-PA elporo y una considerable disociación de CMG2 desde el poro de transición. El tio-accesorio de LFN a la superficie del biosensor se invierte fácilmente por Ditiotreitol. Reducción en la superficie del biosensor BLI libera el LFN-PAprepore-complejo ternario CMG2 o el ácido transición complejos deporo LFN-PA en volúmenes de microlitros. Complejos liberados son luego visualizaron e identificaron con microscopía electrónica y espectrometría de masas. Estos experimentos demuestran cómo supervisar el montaje y desmontaje cinético de complejos de proteínas específicas con metodologías BLI libre de etiqueta y evaluar la estructura y la identidad de estos BLI montado complejos por microscopia electrónica y masa espectrometría, respectivamente, mediante los procedimientos secuenciales de fácil de replicar.
Identificar y comprender la especificidad proteína complejo montaje en vivo es de extremo interés para los investigadores bioquímicos. Montajes de grandes proteínas heterogéneas son la norma más que la excepción. Esta noción es apoyada por monitoreo espectroscópicas en vivo Asamblea, aislar complejos usando suaves técnicas de interrupción de la célula, evaluar los productos de los métodos de purificación basada en afinidad y visualizarlos con alta resolución microscopia electrónica criogénica (cryo-EM). Para entender el control de la especificidad de la Asamblea dentro de la célula, los investigadores deben habitualmente aislar, identificar y finalmente caracterizar estas estructuras dinámicas de montaje/desmontaje. La herramienta molecular más utilizada para identificar los componentes de estos conjuntos con frecuencia requiere inmunoprecipitación basados en anticuerpos, que se basa en mantener la estabilidad de complejo durante la interrupción de la célula. Varias técnicas analíticas acopladas fueron desarrolladas recientemente para capturar complejos de muestras de células utilizan enfoques de microfluídica basada, como resonancia de plasmón superficial (SPR). Después del retiro de las superficies de la SPR, estas muestras fueron analizadas por el tiempo de desorción/ionización láser asistida por matriz de vuelo (MALDI-TOF)1,2. Promover esta metodología utilizando protocolos más fácil permitirá a los investigadores visualizar y validar complejos previstos que ocurren en el medio celular. Ya que la SPR es un sistema de microfluidos, a menudo surgen problemas de la formación de agregados. Eludir este problema requiere dilución de la muestra, que a su vez, puede disminuir la integridad de los complejos biológicos responsables de la concentración.
Un avance relativamente reciente en tecnologías libre de etiqueta es el desarrollo de la biocapa interferometría (BLI) sistema3. Estos reflectancia luz particular emulan sistemas de replicación, o mejor, Unión de SPR y cinéticos resultados a una fracción del costo3,4 sobre todo si se usan unidades de canal único. BLI mide los cambios en los patrones de interferencia de la luz reflejada entre una capa de referencia (control) y la superficie de la biocapa (experimental). El cambio resultante en la fase se mide en tiempo real como una lectura cinética y cuantitativos5. La superficie del biosensor, que contiene químicos de inmovilización específica, se traslada físicamente entre soluciones, frente a cambios de tampón por enfoques de microfluidos en SPR, para medición a través de desviaciones de fase de longitud de onda. Se evitan los efectos de transferencia de masa por agitar la solución. A diferencia de la SPR, estos sistemas son muy útiles en la evaluación de complejos de muestras biológicas crudas. El parámetro físico medido durante experimentos BLI principalmente depende de un cambio de masa o espesor en la superficie del biosensor que resulta de la proteína complejo ensamblaje o desensamblaje.
Estos biosensores ópticos de fibra son relativamente barato y fácil de usar. Uno de los aspectos útiles emergentes de BLI es la fácil eliminación de complejos de la proteína recién montado desde la superficie. Una reciente aplicación de este método permitida a nuestro laboratorio para observar la cinética en tiempo real de gran escala pH inducido por el cambio de estructura de la proteína del componente de antígeno protector (PA) de toxina de ántrax como prepore (PAprepore) la transición a su forma de poro (PAlos poros). Esta transición en la punta del biosensor se verificó mediante microscopia electrónica (EM)6. Eliminación de complejos de superficies biosensores evita efectos de dilución de volumen más grandes frecuentemente encontrados al liberar complejos de superficies de chip al utilizar sistemas de microfluidos.
En el presente trabajo, complejos de toxina de ántrax son montados y desmontados en la superficie del biosensor y luego liberados en volúmenes de microlitros. Los componentes complejos resultantes se validan ortogonalmente utilizando EM y espectrometría de masas (MS).
Esta demostración ilustra cómo la formación de complejos macromolecular puede controlarse fácilmente mediante interferometría de biocapa, visualizado usando EM y se verificó con MS, con microvolúmenes en un corto plazo. Montaje estructural y complejos observados siguen las predicciones biológicamente relevantes, además validar esta metodología combinada. Como se mencionó en la sección de resultados, el elemento clave para el éxito de la Asamblea requiere cisteína racionalmente dirigido mutagénesis para asegurar que las interfaces complejas proteínas están correctamente orientadas lejos de la superficie del biosensor.
Los sistemas anteriores han utilizado técnicas BLI y MS para evaluar la Unión a proteínas de dos y tres sistemas de componentes, así como integridad de atascamiento del receptor de la proteína expresada, pero en ambos casos, los métodos no fueron desarrollados para aprovechar las ventajas del tándem EM/MS enfoque8,9. Sólo otro interferometría sistema que combina el análisis por MS para ayudar a caracterizar las interacciones fue una polarización dual interferometría10. Desafortunadamente, este sistema ya no está disponible para uso general. Como se mencionó en la introducción, ha habido un número de estudios realizados donde las muestras fueron formadas en las superficies de biosensor de SPR-como y extraídas de análisis MS. Ninguno de esos ejemplos dio lugar a complejos visualizados usando EM.
Las limitaciones de este método secuencial pueden ser numerosos, pero son solubles. Para la inmovilización inicial y por lo tanto, paso de la Fundación de la Asamblea, la falta de conocimiento de las superficies de interacción estructural ciertamente impediría avances relacionados con la supervisión de las fases de montaje inicial. La falta de información de la estructura puede ser abordada mediante el diseño de una ingeniería Fundación construir donde químicos de fijación (e.g. sulfidrilo molécula por enlaces disulfuro / su etiquetado posicionamiento) se pueden mover a diversas regiones dentro de la base sistema de montaje. En el caso de la toxina del ántrax complejo, fue una suerte que la estructura del LFN a PAprepore está disponible11. La colocación racional de la cisteína Ingeniería fue localizada a las regiones de la cara PAprepore obligatoria. Con químicos de acoplamiento de cisteína, es preferible que no otras cisteínas reactivas están presentes en la superficie de la proteína.
Existen diversos químicos de accesorio que pueden utilizarse para diseñar el sitio de fijación específicos en las superficies de una proteína. Uno de los más populares accesorios específicos implica posicionar a una molécula de biotina a un lugar específicamente definido en la superficie de la proteína12. Desafortunadamente, Unión de biotina avidina o estreptavidina cubrió superficies es muy apretada. Revocación de la interacción de enlace no es simple. El uso de una ingeniería su-etiqueta en la terminal N o C y la posterior facilidad de adhesión a superficies de Ni-NTA es una aplicación más universal de inmovilización de afinidad. Por supuesto, una de las salvedades para ingeniería sitios de accesorio de montaje con su etiquetado sistemas es el requisito que el termini N y C de la proteína de la Asamblea de base quedan expuestos y que la fijación es fácil. Como con todos los procesos de montaje, la interfaz de interacción de la proteína de la Asamblea de base deberá permanecer disponible conforme avanza la Asamblea compleja.
Quizás la preocupación más común de usar químicas superficie del biosensor es fijación no específica. Consejos de estreptavidina son a menudo una fuente de efectos significativos de fijación no específica. Disulfuro vinculado biotina se puede utilizar para liberar complejos muy específicos, dejando atrás el reducido acoplamiento S-biotina firmemente atado a estreptavidina inmovilizada biosensores13. Existen otros químicos reversibles convertirse en disponible como iminoboronates y a un menor grado ketoamide14. Este campo es actualmente subdesarrollado, pero existe gran interés en seguir desarrollando protocolos covalentes reversibles para evitar efectos de toxicidad de la droga fuera del objetivo que comúnmente acompañan el uso de desarrollo de fármacos específicos covalente.
Una limitación de utilizar EM para visualizar complejos es interpretación, especialmente en casos donde las estructuras de los complejos montados inicialmente no se conocen. La ubicación espacial de componentes dentro de un complejo macromolecular montado indefinido puede identificarse usando los anticuerpos monoclonales (mAb) como marcadores cinéticos y estructurales específicos. Por ejemplo, una vez que se forma un complejo, anticuerpos monoclonales puede añadirse que se unen a componentes específicos. Este método se utiliza con frecuencia en EM para identificar componentes específicos dentro de los grandes ensamblajes15. Otra limitación se relaciona con el tamaño del complejo, aunque ha habido casos donde asambleas simétricas definidas tan pequeñas como 70 kDa (heptamer GroES) son fácilmente resuelven utilizando negativos mancha EM. Complejos ensamblados que son analizados por EM son típicamente en la gama de tamaño de ~ 100 Å de diámetro o más. Recientemente sin embargo, tan pequeñas como 20 kDa proteínas han sido resueltas y estructuras de baja resolución se han obtenido cuando se utiliza a tinción metodologías16superior.
Para el análisis de MS, el aumento de la sensibilidad de la actual instrumentación de MS hasta el nivel femtomolar (attomoles) puede en algunos casos aumentar la sensibilidad de detección de BLI. Es muy concebible que las señales de la proteína que muestran una subida mínima pero repetible en amplitudes dará lugar a la identificación de la proteína en cuestión. Además, las interacciones proteína-proteína con uno de los socios en el biosensor y el otro en un medio celular de sondeo en efecto resultará en una purificación y posteriormente más fácil detección del complejo recién formado. Una limitación que puede observarse con los sistemas actuales de MS muy sensibles es que la proteína de interés no puede ser la base de datos, pero esta observación es poco frecuente (por ejemplo, proteomas de especies raras). Si se conocen las secuencias de las proteínas de interés, este problema se resuelve fácilmente mediante la inclusión de la secuencia de aminoácidos de la proteína en una base de proteína de fondo (como se describe en este trabajo en la sección de protocolo). Otra limitación potencial de los resultados de la metodología de la resistencia de una proteína a trypsinolysis. Digestión de la tripsina es normalmente el método predeterminado para la parte inferior hasta la identificación de proteínas. Sin embargo, las proteínas pueden ser resistentes a la tripsina si carecen de residuos de Arg y Lys o acceso a estos residuos están limitadas por la estructura plegada. Estas limitaciones son resueltos, respectivamente, por alternativa o una combinación de proteasas o incluyendo un despliegue reactivo (urea o guanidina HCl, como se indica en 1.1.14 y 1.2.6) antes de la digestión enzimática.
Posibles expansiones de esta metodología son que permite al usuario seguir e identificar complejos celulares Asamblea de crudo Lisados celulares. Resulta que la prueba para componentes en extractos concentrados celulares es fácil de realizar mediante los procedimientos de interferometría de la biocapa. A diferencia de microfluidos más comúnmente utilizados en metodologías que son propensos a la obstrucción y sensibles a la agregación, el enfoque BLI permite sumergir directamente consejos de sensor de biocapa en extractos crudos de montar potencialmente complejos específicos directamente de estas muestras impuras concentradas. Una vez montado, es perfectamente factible utilizar sondas de anticuerpo específico como seguimiento del sistema BLI para identificar y cuantificar aun los componentes sospechosos en extractos celulares que fueron identificados mediante el método de microvolume MS. Una vez más, la clave aquí es utilizar proteínas núcleo definido, adecuadamente orientado como sondas de afinidad específico.
La capacidad para ver la prepore para proceso de transición cinéticamente con BLI del poro será muy útil en la identificación de potenciales inhibidores de molécula pequeña “antitoxina” de las transiciones de proteína que funcionan específicamente en tarde endosomal, pH bajo (5.0) condiciones. Este prepore pH inducido a transición del poro es inhibida en presencia de plegamiento estabilizador (osmolitos) como glicerol o sacarosa y así presta apoyo para el desarrollo de específicas estabilizadores plegables dirigidos que impiden PA formacióndel poro . Este enfoque específico evita y reemplaza ensayos crudos de agregación donde pH gotas conducen a la precipitación de la proteína. Este método, aunque bueno para métodos de preselección primarios, a menudo conduce a resultados positivos falsos donde específicos compuestos inhiben la agregación en lugar de las transiciones moleculares reales.
Las observaciones posteriores de la estructura y la identificación de los componentes ensamblados dentro de microvolume pequeñas muestras también pueden ser útiles en la validación de potenciales compuestos de plomo. Esto puede aplicarse en casos donde estabilización de montaje específicos o desestabilización es el resultado objetivo. Este enfoque paralelo cinético/estructura/identificación es útil para confirmar directamente la validez de efectores compuesto sospechoso principal de Asamblea y sirve como un paso razonable inspección secundaria o enfoque de rendimiento medio.
Cryo-EM es una técnica útil para el estudio de los detalles atómicos de complejos de macromoléculas en varios Estados de la Asamblea. Antes de la preparación de muestras de cryo-EM, es importante primero verificar que una preparación contiene complejos razonablemente puros homogéneos con tinción negativa EM. El trabajo aquí presentado muestra ensamblaje de complejos de proteína en las superficies de biosensor BLI, liberación de estos complejos para la visualización de la EM y la identificación de estos componentes utilizando MS. Esta particular metodología de Asamblea controlada y liberación puede ser útil en la generación de protocolos muy específicos que mejoran la preparación de muestras secuenciales homogénea para mancha negativa EM, un paso necesario que debe demostrarse antes de avanzar a Cryo-EM. Para obtener la estructura 3D de baja resolución, se necesitarían sólo 30-50 partículas del complejo para realizar una serie de inclinación cónica (70 imagen 2D diferentes puntos de vista por partícula) siempre que haya diversidad de orientación (varias vistas diferentes).
Con respecto a la mejora de métodos de MS, avances en la sensibilidad y la reducción en volumen de la muestra seguirán mejorando. Ciclo de flujos de nano y cromatografía líquida de alta presión junto con el desarrollo de espectrómetros de masas con un servicio rápido, aumento de la sensibilidad y la energía de resolución. Reciente introducción del espectrómetro de masas orbitrap, en particular la última versión (orbitrap Lumos de fusión y su sucesor esperado el Orbitrap fusión Lumos 1M) así como algoritmos de búsqueda facilitan enormemente este proceso.
La metodología actual controla la cinética montaje y desmontaje de componentes de toxina de ántrax utilizando metodologías BLI libre de etiqueta y evalúa la estructura y la identidad de estos componentes usando EM y MS, respectivamente. El uso de un simple canal de sistema BLI junto con rutina negativa tinción análisis de EM y técnicas elementales de MS son más que suficiente para caracterizar un proceso de montaje.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Madison y Lila yo Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC biomédica investigación formación programa (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU tendiendo un puente sobre fondos y la (centro de tecnologías de interacción biomolécula (BITC) Grant CT y SMN). Los autores desean Gracias Barbara Fegley en KUMC centro de microscopia electrónica para obtener ayuda con la adquisición de imágenes TEM.
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |