En Microphysiologic plattform for menneskelig fett: klemt hvit fettvev
Summary
Hvit fettvev (WAT) har kritiske mangler i sin nåværende primære kultur modeller, hindre farmakologiske utvikling og metabolske studier. Her presenterer vi en protokoll for å produsere en adipose microphysiological system av sandwiching WAT mellom ark stromal celler. Denne konstruksjonen gir en stabil og tilpasses plattform for primære WAT kultur.
Abstract
Hvit fettvev (WAT) spiller en avgjørende rolle i å regulere vekt og daglig helse. Likevel er det betydelige begrensninger i tilgjengelige primære kultur modeller, som ikke har trofast recapitulate adipose microenvironment eller utvide WAT levedyktighet utover to uker. Mangelen på pålitelige primære kultur modell hindrer alvorlig WAT metabolisme og narkotika utvikling. Dette har vi benyttet NIHS standarder for et microphysiologic system for å utvikle en ny plattform for WAT primære kultur kalt “SWAT” (klemt hvit fettvev). Vi overvinne naturlig oppdriften i adipocytter av sandwiching hakket WAT klynger mellom ark av liggende under adipose-avledet stromal celler. I denne konstruksjonen er WAT prøvene levedyktig over åtte uker i kultur. SWAT opprettholder den intakt ECM, celle-til-celle kontakter og fysiske presset i vivo WAT forhold; i tillegg opprettholder SWAT en robust transcriptional profil, følsomhet for eksogene kjemiske signalene, og hele funksjon. SWAT representerer en enkel, reproduserbare og effektiv metode for primær adipose kultur. Muligens er det en bredt aktuelt plattform for forskning i WAT fysiologi, patofysiologi, metabolisme og farmasøytisk utvikling.
Introduction
Fettvev er den primære orgelet av fedme, som bærer direkte årlige medisinsk koster mellom $147 milliarder og $210 milliarder i US1. Akkumulering av fettvev bidrar også til andre vanlige dødsårsaker som hjertesykdom, type II diabetes og visse typer kreft2. In vitro kultur modeller er avgjørende for metabolske studier og narkotika utvikling, men dagens forskning modeller av fettvev har større mangler. Adipocytter er skjøre, spenstig, og uhelbredelig differensierte celler som ikke vil følge til celle kultur plast, og derfor kan ikke bli kultivert med konvensjonelle celle kultur metoder. Siden 1970 har flere metoder brukt i forsøk på å overvinne disse barrierene, inkludert bruk av glass coverslips, taket kultur, suspensjon kultur og ekstracellulære matriser3,4,5, 6 , 7. men disse metodene har vært preget av celledød og dedifferentiation, og de brukes vanligvis for ikke mer enn en to-ukers studie periode. Videre forsøk ikke disse modellene recapitulate den opprinnelige adipose microenvironment som de ikke holder intakt ECM, samspillet mellom adipocytter og stromal støtte celler, eller kontraktile styrker cellene øve på hverandre i i vivo WAT.
I fravær av en gull-standard primære adipose kultur metode, adipose forskning har støttet seg hovedsakelig på differensiert pre adipocytter (diffAds). DiffAds er multilocular, tilhenger og metabolically aktiv. Derimot primære hvit adipocytter er unilocular, nonadherent, og demonstrerer relativt lav metabolisme. Manglende gjeldende adipose kultur modeller recapitulate fysiologi av sunn modne fettvev er trolig en viktig faktor i fravær av FDA-godkjente som direkte mot adipocytter. Faktisk er mangel på fysiologiske i vitro orgel modeller et stort problem på de fleste organer og sykdom.
I sin posisjon papir annonsere opprettelsen av Microphysiological Systems (MPS) programmet, rapporterte National Institutes of Health (NIH) at 2013 suksessraten over alle farmasøytiske kliniske studier var bare 18% for fase II og 50% for fase III kliniske studier8. MPS-programmet er utviklet til direkte adresse russernes i vitro monokultur til modell menneskelige fysiologi. NIH definerer MPSs som kultur systemer består av menneskelig primær eller stamceller i flercellet 3D konstruksjoner som recapitulate orgel fungerer. I motsetning til reduksjonistiske modeller av homogen, udødeliggjort cellekulturer, bør MPSs nøyaktig modell celle-celle, narkotika-celle, stoff-stoff og orgel-narkotika interaksjoner9. I motsetning til kortsiktige primære kultur metoder tilsier NIH standarder MPS bærekraft over 4 uker i kultur8. Ytterligere detaljer om MPS programmet finnes på NIHS RFA (#RFA-TR-18-001)10.
Vi har utviklet en enkel, roman, tilpasningsdyktige, og billig adipose MPS kalt “klemt hvit fettvev” (SWAT)11. Vi overvinne naturlig oppdriften i adipocytter av “sandwiching” hakket primære fettvev mellom ark av liggende under adipose-avledet stromal celler (ADSCs) (figur 1). Den resulterende 3D konstruere viser celle-celle kontakten og den opprinnelige adipose microenvironment ved omgir moden adipocytter med en naturlig adipocyte støtte celle befolkning. SWAT er validert ved å demonstrere 8 ukers levedyktighet, svar på eksogene signalering, adipokine sekresjon og engraftment i en dyremodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen detaljer bruk av ADSCs til sandwich menneskelige hvit fettvev; menneskelige ADSC linjer kan isoleres via veletablerte protokoller15. Systemet kan imidlertid være tilpasset individualisert forskning krav (for eksempel ved hjelp av 3T3L-1 celler sandwich musen WAT). Denne prosessen innebærer håndtering primære menneskelig vev. Standard forholdsregler bør brukes; håndtere menneskelig vev som BSL-2 patogener (f.eks HIV, HepC). Bare håndtere vev direkte under en BSC. H…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne institusjonelle støtte fra LSU Health Sciences Center, som finansierte prosjektet.
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
Riferimenti
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- . NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017)
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 – is it thermogenesis?. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
