Påvisning af Protein subcellulært lokalisering af grøn fluorescens Protein Tagging og 4', 6-Diamidino-2-phenylindole farvning i Caenorhabditis elegans
Summary
Denne protokol demonstrerer, hvordan man spore en protein nukleare translokation under varmestress ved hjælp af en grøn fluorescens protein (NGL) fusion protein som en markør og 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning. DAPI farvning protokol er hurtig og bevarer normal god landbrugspraksis og protein subcellulært lokalisering signaler.
Abstract
I denne protokol, en grøn fluorescens protein (NGL) fusion protein og 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning bruges til at spore protein subcellulært lokalisering ændringer; især en nuklear translokation under en varme stress tilstand. Proteiner reagerer tilsvarende til ydre og indre signaler. En fælles mekanisme er at ændre sin subcellulært lokalisering. I denne artikel beskrives en protokol for at spore protein lokalisering, der ikke kræver et antistof, radioaktive mærkning eller en Konfokal mikroskop. I denne artikel bruges normal god landbrugspraksis tagge target proteinet EKSKL-1 i C. elegans, medlem af chlorid intracellulære kanal proteiner (CLICs) familie, herunder pattedyr CLIC4. En integreret translationel ekskl-1::gfp transgene linje (med en promotor og en fuld gensekvens) var lavet af transformation og γ-stråling, og udtrykker stabilt genet og normal god landbrugspraksis. Nyere forskning viste, at ved varmestress, ikke oxidativt stress, EKSKL-1::GFP ophobes i kernen. Overlappende normal god landbrugspraksis signal med både kerner struktur og DAPI signaler bekræfter EKSKL-1 subcellulært lokalisering ændringer under stress. Denne protokol udgør to forskellige fiksering metoder for DAPI farvning: ethanol fiksering og acetone fiksering. DAPI farvning protokollen præsenteret i denne artikel er hurtig og effektiv og bevarer både normal god landbrugspraksis signal og protein subcellulært lokalisering ændringer. Denne metode kræver kun et fluorescens mikroskop med Nomarski, et FITC-filteret og en DAPI filter. Det er velegnet til en lille laboratorium indstilling, bachelor studerende forskning, high school studerende forskning og bioteknologi klasseværelser.
Introduction
En ændring af protein subcellulært lokalisering er en fælles mekanisme som reaktion på interne eller eksterne signaler som varmestress, sult, oxidativ stress, apoptose, protein fosforylering, og andre. For eksempel, inducerer varmestress FOXO medlem DAF-16 nukleare translokation1,2, og den pro-apoptotiske BCL-2 protein bud translocates til mitokondrier ved modtagende død signalering3,4. Der findes forskellige teknikker til at opdage disse ændringer. En kombination af western blotting og biokemisk isolere subcellulært strukturer (fx, mitokondrier eller kerner) kunne godt nå mål3. Det kræver dog et specifikt antistof mod protein af interesse. Således, en veletableret antistof bliver nøglen til succes. En alternativ fremgangsmåde er at mærke forskellige subcellulært strukturer eller organeller med forskellige markører som grønne fluorescens protein (NGL), røde fluorescens protein (RFP), gul fluorescens protein (YFP) og mCherry, og i mellemtiden label protein af interesse med andre markører. Derefter skal overholde dem under en Konfokal mikroskop til at lokalisere mål5,6. Radioaktive isotoper er en alternativ valg for mærkning target proteiner og derefter opdage deres subcellulært lokalisering7. Denne metode kræver imidlertid korrekt træning og håndtering af radioaktivt affald. Under omstændigheder som manglen på en bestemt antistof, mangel på en ordentlig markør eller sjældenhed af udstyr såsom en Konfokal mikroskop skal en alternativ tilgang overvejes. For at identificere et protein nukleare translokation, er det attraktivt at kun mærke mål proteiner med en markør og at pletten kerner med kemisk reagens 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) da dette kun kræver en regelmæssig fluorescens mikroskop.
Immunolabeling C. elegans med antistoffer er udfordrende på grund af lav permeabilitet af enten æggeskallen eller kollagen neglebånd omkring dyret. I mellemtiden, da C. elegans proteiner er væsentligt forskellige fra deres hvirveldyr orthologs, et par kommercielle virksomheder giver C. elegans med specifikke produkter. Det er svært for en lille laboratorium til at generere C. elegans antistoffer for sig selv. Forskere i Fællesskabet bruger ofte mærket proteiner som markører til at demonstrere en protein lokalisering eller gene expression. Denne artikel bruger EKSKL-1::GFP som et eksempel til at spore en protein nukleare translokation under varme stress8. En integreret translationel ekskl-1::gfp til det animalske genom bruges til stabilt express gen med normal god landbrugspraksis fusion. Forskning har vist, at ekskl-1 udtrykkes i tarmen, kroppen væggen muskel og andre subcellulært strukturer8. Denne protokol demonstrerer, hvordan du synkroniserer orme til den fjerde larve (L4) fase, udføre en varme stress eksperiment, og adfærd DAPI farvning, ethanol fiksering, acetone fiksering og imaging under en regelmæssig fluorescens mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel præsenteres en hurtig og effektiv metode til at kontrollere protein subcellulært ændringer fra cytoplasmaet til kernen. Protein udtryk var vist af en normal god landbrugspraksis fusion, mens kernen struktur blev bekræftet af DAPI farvning (figur 3). Da immunfarvning C. elegans proteiner er udfordrende, de fleste C. elegans protein subcellulært lokaliseringer er karakteriseret ved at kode dem med markør proteiner som normal god landbrugspraksis, Laz, mC…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. elegans stammer anvendes i denne undersøgelse blev indhentet fra byens Caenorhabditis genetik, som støttes af National Institutes of Health – Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang og PSC-CUNY 66184-00 44 og 67248-00 45 til Jun Liang. Vi takker Cathy vild-Dunn for venligst deler hendes laboratorium plads. Alle fluorescens billeder blev indsamlet på Queens College Core facilitet. Vi takke William J. Rice for hans kommentarer til manuskriptet.
Materials
| DAPI | Biotium | 40043 | both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | soft tissue | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | fluorescence microscope | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | microscope software | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | digital camera | |
| Incubator | |||
| Micro centrifuge | |||
| Transparent nail polish gel | |||
| 60 mm petri dishes | |||
| Glass slides | |||
| Glass coverslips | |||
| 1-20 µL pipettor | |||
| 20-200 µL pipettor | |||
| 200-1000 µL pipettor | |||
| 1-200 µL pipet tips | |||
| 200-1000 µL pipet tips | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Platinum wire worm pick |
Riferimenti
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
- Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
- Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
- Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).
- Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
- Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
- Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , (2006).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , (2006).
- Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
- Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
- Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
- He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
- Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
- Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
- Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).
- Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
- Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
- Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
- Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
- Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetica. 198 (1), 193-207 (2014).
- Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
- Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).
