Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af In Situ hybridisering
Summary
mikro-RNA’er (miRNAs) er korte og meget homologe RNA sekvenser, der tjener som post-transcriptional regulatorer af messenger RNA’er (mRNAs). Nuværende miRNA påvisningsmetoder varierer i følsomhed og specificitet. Vi beskriver en protokol, der kombinerer i situ hybridisering og immunfarvning for samtidige påvisning af miRNA og protein molekyler på musen hjerte væv sektioner.
Abstract
mikro-RNA’er (miRNAs) er enkeltstrenget RNA afskrifter, der binder til messenger RNA’er (mRNAs) og hæmme deres oversættelse eller fremme deres nedbrydning. Til dato, har miRNAs været impliceret i en lang række biologiske og sygdom processer, som har tilkendegivet nødvendigheden af metoderne pålidelig detektering af miRNA udskrifter. Her beskriver vi en detaljeret protokol til digoxigenin-mærket (grave) låst nukleinsyre (LNA) sonde-baserede miRNA påvisning, kombineret med protein immunfarvning på musen hjerte sektioner. Vi uropført en i situ hybridisering teknik bruger sonden til at identificere miRNA-182 udtryk i hjertet sektioner fra kontrol og Hjertehypertrofi mus. Næste, vi udførte immunfarvning for kardiale Troponin T (cTnT) protein, på de samme strækninger, at co lokalisere miRNA-182 med cardiomyocyte celler. Ved hjælp af denne protokol, var vi købedygtig opdager miRNA-182 gennem en alkalisk fosfatase baseret kolorimetriske assay og cTnT gennem fluorescerende farvning. Denne protokol kan bruges til at registrere udtryk for enhver miRNA interesse gennem grave-mærket LNA sonder og relevante protein udtryk på musen hjerte væv sektioner.
Introduction
mikro-RNA’er (miRNAs) er korte (18 – 25 nukleotider), enkelt-strenget, noncoding RNA’er, der fungerer som negative regulatorer af genekspression på det post-transcriptional niveau af hæmme messenger RNA (mRNA) oversættelse og/eller fremme mRNA nedbrydning 1. miRNAs er transskriberet fra introner eller exons kodning eller noncoding gener og er kløvet i kernen af DROSHA, at forløber miRNAs (pre-miRNAs), som er korte stem-loop strukturer af 70 nukleotider2. Efter cytoplasmatisk eksport, pre-miRNAs forarbejdes yderligere af DICER til modne miRNAs, der strækker sig over 18 – 25 nukleotider3,4. Efterfølgende, indarbejder den RNA-induceret silencing complex (RISC) disse miRNAs som enkeltstrenget RNA’er, som gør det muligt for deres binding til den 3′ utranslaterede region (3′-UTR) af deres mål mRNAs at undertrykke deres udtryk3,5 .
Inden for de sidste tre årtier, siden de blev først identificeret, opstået miRNAs til master regulatorer af genekspression, hvis eget udtryk niveauer er stramt kontrolleret6. Roller for miRNAs har været beskrevet i orgel udvikling7,8,9,10,11,12, opretholdelse af homeostase13,14 , samt sygdom sammenhænge, der omfatter neurologiske15,16,17,18,19, hjerte-kar-20, autoimmune sygdomme21 ,22, kræft23,24, og andre25. Den stigende forståelse for relevansen af miRNA udtryk mønstre har fremsat behovet for pålidelige påvisningsmetoder af miRNA udskrifter. Disse metoder omfatter Real Time PCR, microarrays, nordlige Blotting, i situ hybridisering og andre, som varierer i følsomhed, specificitet og kvantitative strøm, overvejende at miRNA udskrifter består af korte og stærkt homologe sekvenser6.
Vi har for nylig rapporteret en vigtig rolle for miRNA-182 i udvikling af myokardieinfarkt hypertrofi26, en tilstand, der beskriver den strukturelle tilpasning af hjertet som reaktion på forhøjet hæmodynamiske krav27,28. Hjertehypertrofi er karakteriseret ved stigning i Myokardie massen, som hvis forbundet med utilpasset remodeling29, kan føre til øget risiko for hjertesvigt, en tilstand, der tegner sig for 8,5% af alle dødsfald skyldes hjerte-kar- sygdom30.
Her beskriver vi vores protokol, der kombinerer i situ hybridisering med digoxigenin-mærket (grave) låst nukleinsyre (LNA) sonde og immunfarvning for samtidige påvisning af miRNA og protein molekyler på musen hjerte væv sektioner, i vores model af Hjertehypertrofi.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNA udskrift afsløring kan opnås gennem forskellige teknikker, der varierer i følsomhed, specificitet og kvantitative magt. Her, vi påvise kobling af miRNA i situ hybridisering med immunfarvning og beskrive en protokol, der giver mulighed for samtidige vurdering af udtryk niveauer af miRNA og protein molekyler, på de samme hjerte sektioner. Først viser vi hvordan du udfører i situ hybridisering af grave-mærket LNA miRNA sonder på paraffinsnit indlejret hjerte. Næste, vi beskriver, hvordan du…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Athanasios Papangelis, for kritiske kommentarer til manuskriptet. FM er støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP er støttet af American Heart Association videnskabsmand udvikling Grant (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
Riferimenti
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
