टिशू-विशिष्ट miRNA में अभिव्यक्ति की रूपरेखा माउस दिल वर्गों में प्रयोग सीटू संकरण
Summary
सूक्ष्म RNAs (miRNAs) छोटे और अत्यधिक मुताबिक़ आरएनए अनुक्रम, दूत RNAs (mRNAs) के बाद transcriptional नियामकों के रूप में सेवारत हैं । वर्तमान miRNA डिटेक्शन पद्धतियां संवेदनशीलता और विशिष्टता में बदलती हैं । हम एक प्रोटोकॉल है कि सीटू संकरण और माउस दिल ऊतक वर्गों पर miRNA और प्रोटीन अणुओं का समवर्ती पता लगाने के लिए immunostaining में जोड़ती है का वर्णन ।
Abstract
माइक्रो-RNAs (miRNAs) एकल-असहाय आरएनए टेप हैं जो दूत RNAs (mRNAs) को बाँधते हैं और उनके अनुवाद को बाधित करते हैं या उनके क्षरण को बढ़ावा देते हैं. तिथि करने के लिए, miRNAs जैविक और रोग प्रक्रियाओं है, जो miRNA टेप के विश्वसनीय पता लगाने के तरीकों की आवश्यकता का प्रतीक है की एक बड़ी संख्या में फंसाया गया है । यहां, हम digoxigenin के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन-लेबल (खुदाई) न्यूक्लिक एसिड बंद (LNA) जांच आधारित miRNA का पता लगाने, माउस दिल वर्गों पर प्रोटीन immunostaining के साथ संयुक्त । सबसे पहले, हम नियंत्रण और हृदय अतिवृद्धि चूहों से हृदय वर्गों में miRNA-१८२ अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए जांच का उपयोग कर सीटू संकरण तकनीक में एक प्रदर्शन किया । अगले, हम कार्डियक ट्रोपोनिन टी (cTnT) प्रोटीन के लिए immunostaining प्रदर्शन किया, एक ही वर्गों पर, सह करने के लिए miRNA-१८२ cardiomyocyte कोशिकाओं के साथ स्थानीयकृत । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम एक alkaline फॉस्फेट आधारित वर्णमिति परख के माध्यम से miRNA-१८२ का पता लगाने में सक्षम थे, और फ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से cTnT । इस प्रोटोकॉल के लिए खुदाई के माध्यम से ब्याज की किसी भी miRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेबल LNA जांच, और माउस दिल ऊतक वर्गों पर प्रासंगिक प्रोटीन अभिव्यक्ति ।
Introduction
माइक्रो-RNAs (miRNAs) लघु (18 – 25 न्यूक्लियोटाइड), एकल-कतरा, गैर-कोडिंग RNAs है जो दूत आरएनए (transcriptional) अनुवाद को बाधित करके mRNA स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के नकारात्मक नियामकों के रूप में कार्य करता है या mRNA क्षरण को बढ़ावा देता है 1. miRNAs introns या कोडिंग या गैर कोडिंग जीन के exons से लिखित और DROSHA द्वारा नाभिक में सट रहे हैं, के प्रणेता miRNAs (पूर्व miRNAs), जो कम स्टेम ७० न्यूक्लियोटाइड2के पाश संरचनाओं हैं । cytoplasmic निर्यात के बाद, पूर्व miRNAs आगे परिपक्व miRNAs में DICER द्वारा संसाधित कर रहे है कि अवधि 18-25 न्यूक्लियोटाइड3,4। इसके बाद, आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने कॉम्प्लेक्स (RISC) को इन miRNAs को एकल-असहाय RNAs के रूप में शामिल किया गया है, जो उनके लक्ष्य UTR के 3 ‘ अनअनुवादित क्षेत्र (3 ‘-mRNAs) को उनकी अभिव्यक्ति को दबाने के लिए बाइंडिंग के लिए अनुमति देता है3,5 .
पिछले तीन दशकों के भीतर, क्योंकि वे पहली बार पहचाने गए थे, miRNAs जीन अभिव्यक्ति, जिनकी अपनी अभिव्यक्ति का स्तर कसकर6नियंत्रित कर रहे है के मास्टर नियामकों के लिए उभरा है । miRNAs के लिए भूमिकाएं अंग विकास में वर्णित किया गया है7,8,9,10,11,12, homeostasis के रखरखाव13,14 , साथ हीरोग संदर्भों कि स्नायविक15,16,17,18,19, हृदय20, स्व-प्रतिरक्षित शर्तों21 शामिल ,22, कैंसर23,24, और अंय25। miRNA अभिव्यक्ति पैटर्न की प्रासंगिकता के लिए बढ़ती सराहना आगे miRNA टेप के विश्वसनीय पता लगाने के तरीकों के लिए की जरूरत है लाया है । इस तरह के तरीकों में वास्तविक समय पीसीआर, microarrays, उत्तरी सोख्ता, सीटू संकरण और दूसरों में , जो संवेदनशीलता, विशिष्टता, और मात्रात्मक शक्ति में बदलती हैं, मुख्य रूप से तथ्य यह है कि miRNA टेप लघु और शामिल है के कारण अति मुताबिक़ जुगाड़6.
हम हाल ही में रोधगलन अतिवृद्धि26के विकास में miRNA-१८२ के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की रिपोर्ट, एक ऊंचा hemodynamic मांगों के जवाब में दिल के संरचनात्मक अनुकूलन का वर्णन शर्त27,28। कार्डिएक अतिवृद्धि रोधगलन, जो, अगर maladaptive के साथ जुड़े29remodeling, दिल की विफलता के लिए बढ़ा जोखिम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं में वृद्धि की विशेषता है, सभी हृदय के लिए विशेषता मृत्यु का ८.५% के लिए एक स्थिति लेखांकन रोग३०.
यहां, हम अपने प्रोटोकॉल का वर्णन है कि एक digoxigenin के साथ सीटू संकरण में जोड़ती है लेबल (खुदाई) न्यूक्लिक एसिड (LNA) जांच और immunostaining के समवर्ती का पता लगाने के लिए miRNA और माउस दिल ऊतक वर्गों पर प्रोटीन अणुओं को बंद कर दिया, में हमारे कार्डियक अतिवृद्धि का मॉडल ।
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNA प्रतिलिपि का पता लगाने विभिंन तकनीकों है कि संवेदनशीलता, विशिष्टता और मात्रात्मक शक्ति में भिंनता के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । यहां, हम immunostaining के साथ सीटू संकरण में miRNA के युग्मन प्रदर्शन ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण टिप्पणी के लिए Athanasios Papangelis, शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । एफएम जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित है (BBSRC; BB/M009424/ आईपी अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान (17SDG33060002) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
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