Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Summary

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Abstract

Gereglementeerde exocytose is een proces dat door die lading, die is opgeslagen in secretoire korrels (SGs), is uitgebracht in reactie op een secretoire trigger. Gereglementeerde exocytose is van fundamenteel belang voor de intercellulaire communicatie en is een belangrijk mechanisme voor de secretie van neurotransmitters, hormonen, inflammatoire mediatoren en andere verbindingen, door een aantal cellen. Ten minste drie verschillende mechanismen staan bekend om gereglementeerde exocytose: volledige exocytose, waar een enkele SG volledig met het plasma-membraan, kus-en-run exocytose versmelt, waar een enkele SG Transient met het plasma-membraan combineert, en samengestelde exocytose, waar verschillende SGs zekering met elkaar, vóór of na SG fusion met het plasma-membraan. Het soort gereglementeerde exocytose ondernomen door een cel wordt vaak bepaald door het soort secretoire trigger. Echter in veel cellen, kunt één secretoire trigger activeren meerdere modi van gereglementeerde exocytose gelijktijdig. Ondanks hun overvloed en belang in de celtypen en soorten zijn de mechanismen die bepalend zijn voor de verschillende vervoerstakken secretie grotendeels onbekend. Een van de belangrijkste uitdagingen bij het onderzoeken van de verschillende modi van gereglementeerde exocytose, is het moeilijk onderscheid te maken tussen hen, evenals het verkennen van hen afzonderlijk. Hier beschrijven we het gebruik van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran als exocytose verslaggever en levende cel imaging, om te differentiëren tussen de verschillende trajecten van gereglementeerde exocytose, gericht op samengestelde exocytose, op basis van de robuustheid en duur van de exocytic gebeurtenissen.

Introduction

Gereglementeerde exocytose is het primaire mechanisme waarmee gemakkelijk gemaakt lading wordt vrijgelaten uit een secretoire cel in antwoord op een specifieke trigger. De lading is pre gevormd en afgezonderd in secretoire blaasjes, waarin het is opgeslagen totdat een trigger Relais het signaal voor de vrijlating van de SGs inhoud. Verschillende soorten signalen kunnen resulteren in verschillende modi van gereglementeerde exocytose of verschillende modi van gereglementeerde exocytose tegelijkertijd kunnen optreden. Drie belangrijkste wijzen van gereglementeerde exocytose zijn bekend: volledige exocytose, waarbij volledige fusie van een enkele secretoire submodule met het plasmamembraan; kus-en-run exocytose, waarbij voorbijgaande fusie voor de secretoire granule met het plasma-membraan gevolgd door haar recycling; en samengestelde exocytose, die wordt gekenmerkt door homotypic fusie van verschillende SGs prior (dat wil zeggen, multigranular exocytose) of na elkaar (dat wil zeggen, sequentiële exocytose) tot fusie met het plasmamembraan¹. Samengestelde exocytose wordt beschouwd als de meest uitgebreide modus van lading release², omdat het zorgt voor de snelle afscheiding van vracht, met inbegrip van die van SGs die zich bevinden distale uit het plasma-membraan. Samengestelde exocytose is gedocumenteerd in beide exocrine en endocriene cellen^{3,4,5,6,7,8,9}, evenals in immuuncellen. Samengestelde exocytose kunt immune cellen, zoals eosinofielen^10,11,12 en neutrofielen¹³, de snelle en robuuste versie van bemiddelaars die nodig zijn voor het doden van invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën of parasieten. Mastcellen (MCs) implementeren samengestelde exocytose voor de efficiënte introductie van vooraf opgeslagen inflammatoire mediatoren tijdens aangeboren immuunresponsen, anafylaxie en andere allergische reacties^{14,15,16 , 17}. aangezien de verschillende modi van exocytose gelijktijdig^{18,19 treedt}, is het een uitdaging onderscheid maken tussen hen in real-time of identificeren van hun respectieve fusion machineries, vandaar ophelderen geworden hun onderliggende mechanismen.

Hier presenteren we een methode, gebaseerd op de levende cel beeldvorming van cel geladen FITC-dextran, waarmee real-time tracking van exocytic evenementen en onderscheid te maken tussen hun verschillende modi. Onze werkwijze zorgt voor met name de exclusieve opvolging van samengestelde exocytose.

FITC-dextran is een geconjugeerde van de pH-gevoelige fluorophore FITC met de glucan polysaccharide dextran. Fluorescently geëtiketteerde dextrans hebben aangetoond dat de cel invoeren door micropinocytosis^20,21 en macropinocytosis^22,23. Naarmate endocytotische compartimenten in de lysosomen rijpen, is gebleken dat de FITC-dextran in het lysosoom met geen zichtbare aantasting accumuleert. Echter, aangezien FITC een zeer pH-gevoelige fluorophore^{24 is}, en het lysosoom lumen zuur is, Lest FITC-dextran fluorescentie bij het bereiken van het lysosoom²⁴. Dus, tot vaststelling van dextrans als lysosoom lading, samen met de gevoeligheid van de pH van FITC gericht, hebben de basis gelegd voor het gebruik van FITC-dextran in studies van lysosoom exocytose^{25,26,27 , 28 , 29}.

In verschillende celtypen, met inbegrip van MCs, neutrofielen eosinofielen, cytotoxische T-cellen, melanosomes en anderen, de SGs lysosomale functies weergegeven en zijn geclassificeerd als lysosoom-gerelateerde organellen (LROs) of secretoire lysosomen^30,31 . Aangezien LROs een zure luminal pH hebben, kan FITC-dextran worden gebruikt om te visualiseren van hun exocytose, als gevolg van hogere pH die is gekoppeld aan de exteriorization van de LROs. Inderdaad, FITC-dextran is gebruikt om te controleren van exocytose in MCs^18,32,33. Bij deze methode is FITC-dextran toegevoegd aan de celcultuur, in beslag genomen door de cellen door Pinocytose en gesorteerd in de SGs. Aangezien er in de lysosomen, is FITC fluorescentie uitgeblust in de SGs wanneer zij binnen de cel. Echter bij SG fusion met het plasmamembraan en daaruit voortvloeiende blootstelling aan de externe omgeving herwint de FITC-dextran zijn fluorescentie als de SG pH stijgt, waardoor het eenvoudig volgen van exocytic evenementen door levende cel microscopie. Hier, we deze methode zodat unieke tracking van samengestelde exocytose aangepast.

Twee andere methoden hebben eerder is gebruikt voor het bijhouden van samengestelde exocytose. Elektronenmicroscopie was de eerste methode te karakteriseren exocytic structuren die het vóórkomen van de verschillende vervoerswijzen exocytose voorgesteld. Met name gaf opmerkingen van “secretoire tunnels” in de alvleesklier acinaire cellen³⁴ en MCs^35,36,^,37 aanleiding tot de hypothese van samengestelde exocytose. Maar terwijl de hoge resolutie van elektronenmicroscopie bevoegd is om te onthullen gesmolten blaasjes, kan de dynamiek van hun fusie niet bijhouden en dus geen definiëren of ze overeenkomen met SG fusion tijdens samengestelde exocytose of fusie van heroverde korrels na hun endocytose. Dit obstakel overwonnen in andere methoden die exocytose in levende cellen, zoals patch klem metingen van het plasmamembraan capaciteit^11,13,38,39 of amperometry meten kunnen ⁴⁰ van de media. Echter patch klemmen vereist een speciale set-up en mogelijk niet geschikt voor alle celtypes. Amperometry metingen kunnen bijhouden van exocytose alleen als de lading in zeer dicht bij de elektrode wordt vrijgegeven. Dus, met behulp van levende cellen imaging biedt een voordeel ten opzichte van deze methoden, zoals het niet alleen voor real-time tracking van exocytose staat, maar het biedt ook snelle en eenvoudige overname van gegevens uit de hele cel.

Het volgen van FITC-dextran door levende cel microscopie biedt ook enkele voordelen naar andere levende cel imaging gebaseerde methoden. Bijvoorbeeld, is een veel gebruikte methode totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) van cellen met een fluorescente sonde SG geladen of uiting van een fluorescente proteïne-gelabeld SG vracht of membraan eiwit^{26,41, 42 , 43}. de kracht van deze methode ligt in zijn vermogen om uitsluitend gebeurtenissen die zich voordoen vlak bij het plasma-membraan (hierna te noemen voetafdruk), te controleren dus exocytic gebeurtenissen. Dit is echter ook het nadeel van deze methode omdat slechts in het geval van de cel-fractie dat grenst aan het dekglaasje en dicht bij de lens Microscoop kan worden beeld⁴⁴. Of dergelijke voetafdrukken inderdaad het gehele celmembraan oppervlak vertegenwoordigen is nog betwistbaar^45,46,47. In dit verband kunt met behulp van een pH-gevoelige kleurstof zoals FITC-dextran en een standaard fluorescentie Microscoop of een confocal microscoop met een open pinhole beeldvorming van de hele cel, dus het vastleggen van de totale exocytic-gebeurtenissen die in die cel plaatsvinden.

Extra pH-gevoelige verslaggevers die worden gebruikt voor het bestuderen van gereglementeerde exocytose door hele cel beeldbewerkings- of TIRFM bevatten SG vracht of SG membraan eiwit gesmolten tot phlourin, een pH-gevoelige GFP variant. Voorbeelden zijn NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, en synapto-phluorin^{48,49,50,51,52}. Terwijl uitdrukking van deze sondes de endogene samenstelling van de SGs nauwer vertegenwoordigen kan, het impliceert transfectie van de cellen, en kan dus minder geschikt voor cellen die moeilijk te transfect. Daarom, wanneer bestuderen van cellen die zijn moeilijk te transfect of onder experimentele omstandigheden waarvoor meerdere genomic manipulaties, is het gebruik van een stof die eenvoudig kan worden aangevuld in het kweekmedium cel, zoals FITC-dextran, voordelig . FITC-dextran biedt ook een voordeel ten opzichte van acridine oranje (AO), een andere pH-gevoelige kleurstof die is gebruikt voor het volgen van exocytose door levende cel microscopie^{53,54,55,56 , 57 , 58}. AO is gebleken voor het opwekken van fotolyse van blaasjes dat resultaat in valse flitsen, die niet met werkelijke secretie overeen komen²⁷verwerkt. Daarentegen weerspiegelt de FITC-dextran beter secretie evenementen, waarschijnlijk als gevolg van zijn lage foto-geïnduceerde productie van reactieve zuurstof²⁷.

Met name is een alternatieve benadering voor het bestuderen van exocytose door het bijhouden van de instroom van een kleurstof, uit het externe medium in de SG via de porie van fusie dat wordt tijdens dit proces wordt geopend. In dit geval wordt de kleurstof toegevoegd aan het externe medium naast de secretoire trigger. Vervolgens, wanneer de fusie porie opent, de kleurstof diffundeert in de SG^59,60. Een duidelijk voordeel van deze methode is dat het biedt ook de mogelijkheid om het inschatten van de fusion porie maat, door het gebruik van kleurstoffen van variabele grootte. Bijvoorbeeld, kunnen dextrans met verschillende molecuulgewicht (MW), geconjugeerd met verschillende fluorophores, worden gebruikt als extracellulaire kleurstoffen waarbij de maximale grootte van Dextraan die de SG doordringen kan zou overeenkomen met de grootte van de fusion porie^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. Bovendien deze aanpak vereist niet het gebruik van een pH-gevoelige sonde. Een aanzienlijk nadeel is echter dat de signaal / ruisverhouding zeer laag is, is aangezien een grote hoeveelheid kleurstof aanwezig in de media tijdens de overname van beelden, wat resulteert in hoge achtergrond.

Globaal, het gebruik van FITC-dextran als een marker voor exocytose overwint verschillende nadelen in reeds gerapporteerde methoden, zoals de signaal-ruis verhouding, toxiciteit, dynamische tracering en complexiteit.

Hier beschrijven we het gebruik van FITC-dextran samengestelde exocytose in de RBL – 2H 3 mestcel lijn (hierna te noemen RBL, voornamelijk opgericht door Eccleston et al. volgen ⁶⁵ en verder door Barsumian et al. gekloond ⁶⁶), in reactie op immunoglobuline (IgE) / antigeen (Ag) activering.

Protocol

1. voorbereiding Bereiding van de voedingsbodems RBL Mix 500 mL van lage glucose Dulbecco bewerkt Eagle’s medium (DMEM) met 56 mL foetale runderserum (FBS), 5,5 mL penicilline-streptomycine-nystatine oplossing, 5,5 mL van L-Glutamine 200 mM oplossing. Dit resulteert in lage glucose DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 µg/mL streptomycine, 100 eenheden/mL penicilline, 12 eenheden/mL nystatine en 2 mM L-glutamine. De media filteren met behulp van een top-vacuüm-filter van 0,22 µm poriegrootte en …

Representative Results

Figuur 1a vertegenwoordigt schematisch hoe FITC-dextran kan fungeren als een verslaggever voor geregeld exocytose en herhalen van de verschillende modi van exocytic gebeurtenissen. Ten eerste, de cellen worden geïncubeerd met FITC-dextran, die door Pinocytose geïnternaliseerd en gesorteerd naar de SGs. Aangezien de SGs van MCs LROs, hun lage pH dempt de fluorescentie van FITC, hier weergegeven als zwarte korrels (A-C, ik). Wanneer cellen worden getriggerd d…

Discussion

Hier beschrijven we hoe traceren de fluorescentie van FITC-dextran in SGs geladen kan worden gebruikt om het speciaal samengestelde exocytose van gebeurtenissen. Dit werd bereikt door de Microscoop te verwerven van een afbeelding elke 15 seconden, aldus voor te zorgen dat alleen langdurige gebeurtenissen na verloop van tijd worden vastgelegd en dus met uitzondering van korte gebeurtenissen die zou overeenkomen met volledige exocytose of kus-en-run exocytose. Om vast te stellen van de methode, toonden we dat knockdown van…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67