تصوير فيتك-ديكستران كمراسل للرقابة الخاضعة للتنظيم

Summary

هنا نحن بالتفصيل طريقة لتصوير الخلايا الحية للرقابة الخاضعة للتنظيم. ويستخدم هذا الأسلوب فيتك-ديكستران، التي تتراكم في العضيات يحلول المتصلة، كمراسل. كما يسمح هذا الأسلوب البسيط التمييز بين أنماط مختلفة من الرقابة الخاضعة للتنظيم في الخلايا التي يصعب التلاعب وراثيا.

Abstract

ينظم الرقابة هي عملية الذي هو الإفراج عن البضائع، التي يتم تخزينها في الحبيبات الافرازية (SGs)، استجابة لمشغل افرازية. ينظم الرقابة الأساسية للاتصال بين الخلايا وآلية رئيسية لإفراز العصبية والهرمونات، ووسطاء التهابات وغيرها من المركبات، من مجموعة متنوعة من الخلايا. معروفة على الأقل ثلاث آليات متميزة لتنظيم الرقابة: الرقابة الكاملة، حيث الصمامات سان جرمان واحدة تماما مع غشاء البلازما، قبله وتشغيل الرقابة، حيث الصمامات سان جرمان واحد عابر مع غشاء البلازما، ومجمع الرقابة، أين SGs عدة تلتحم مع بعضها البعض، قبل أو بعد الانصهار سان جرمان مع غشاء البلازما. النوع من التنظيم الرقابة التي يضطلع بها خلية غالباً ما تمليه نوع المشغل الافرازية. ومع ذلك، في العديد من الخلايا، مشغل افرازية واحدة يمكن تنشيط وسائط متعددة من الرقابة الخاضعة للتنظيم في وقت واحد. رغم وفرة وأهمية عبر أنواع الخلايا والأنواع، الآليات التي تحدد أنماط مختلفة من إفراز دون حل إلى حد كبير. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه في التحقيق في أوضاع مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم، هو الصعوبة في التمييز بينهما، فضلا عن استكشاف لهم بشكل منفصل. هنا يصف لنا استخدام fluorescein isothiocyanate (فيتك)-ديكستران كمراسل الرقابة، والخلية الحية التصوير، وتفرق بين مسارات مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم، مع التركيز على مجمع الرقابة، استناداً إلى مدى متانة و المدة للأحداث التي وقعت في اكسوسيتيك.

Introduction

ينظم الرقابة هو الآلية الرئيسية التي الإفراج عن البضائع بسهولة من خلية افرازية ردا على مشغل معين. البضائع قبل تشكيلها والمحتبس في الحويصلات الافرازية، الذي يتم تخزينه حتى مشغل التبديلات إشارة للإفراج عن محتوى SGs. ينتج أنواع مختلفة من إشارات في أوضاع مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم، أو قد تحدث أوضاع مختلفة للرقابة الخاضعة للتنظيم في وقت واحد. يعرف ثلاث طرق رئيسية لتنظيم الرقابة: الرقابة الكاملة، الذي ينطوي على الانصهار الكامل من الحبيبية الافرازية واحد مع غشاء البلازما؛ قبله تديره والرقابة، الذي ينطوي على الانصهار عابر الحبيبية الافرازية مع غشاء بلازما تليها إعادة تدويرها؛ ومجمع الرقابة، التي تتسم بالانصهار هوموتيبيك عدة من قبل شركة SGs (أي، الرقابة مولتيجرانولار) أو متسلسلة (أي، الرقابة التسلسلية) إلى الانصهار مع غشاء البلازما¹. مجمع الرقابة يعتبر الوضع الأكثر شمولاً لشحن الإصدار²، كما أنه يسمح لإفراز سريع لنقل البضائع، بما في ذلك من شركة SGs التي تقع القاصي من غشاء البلازما. وقد تم توثيق الرقابة المركبة في كل خلايا إفرازات والغدد الصماء^{3،4،5،6،7،،}من⁸⁹، وكذلك في الخلايا المناعية. في الخلايا المناعية، مثل الحمضات^10،،من¹¹¹² والعدلات¹³، يسمح الرقابة مركبة إطلاق سراح سريعة وقوية من الوسطاء المطلوبة لقتل مسببات الأمراض الغازية مثل البكتيريا أو الطفيليات. نشر خلايا ماست (MCs) الرقابة مجمع للإفراج عن كفاءة الوسطاء التحريضية المخزنة مسبقاً خلال الاستجابات المناعية الفطرية والحساسية المفرطة، وأخرى الحساسية^14،،من^{1516 , 17}-نظراً لأوضاع مختلفة للرقابة يمكن أن تحدث في نفس الوقت^18،19، فقد أصبح يشكل تحديا للتمييز بينهما في الوقت الحقيقي أو لتحديد آلياتها الانصهار كل منهما، ومن ثم توضيح آلياتها الأساسية.

نقدم هنا أسلوب، يقوم على خلية حية تحميل تصوير الخلية فيتك-ديكستران، الذي يسمح بتتبع الوقت الحقيقي للأحداث اكسوسيتيك والتمييز بين أساليب مختلفة. على وجه الخصوص، لدينا أسلوب يسمح رصد الرقابة مجمع الخالصة.

فيتك-ديكستران هو المتقارن من فلوروفوري حساسة لدرجة الحموضة فيتك مع ديكستران السكاريد غلوكان. ديكسترانس المسمى فلوريسسينتلي تبين أن إدخال الخلية ميكروبينوسيتوسيس^20،21 وماكروبينوسيتوسيس^،من²²²³. المقصورات اندوسيتيك الناضجة في lysosomes، قد ثبت أن فيتك-ديكستران يتراكم في يحلول مع لا تدهور واضح. ومع ذلك، منذ فيتك fluorophore جداً حساسة لدرجة الحموضة²⁴، والتجويف يحلول الحمضية، يروي fluorescence فيتك-ديكستران عند بلوغ يحلول²⁴. وبالتالي، إنشاء ديكسترانس كما يحلول استهداف البضائع، جنبا إلى جنب مع حساسية الأس الهيدروجيني فيتك، قد أرست الأساس لاستخدام فيتك-ديكستران في الدراسات يحلول الرقابة^25،،من^{2627 , 28 , 29}.

في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الإشراف، العَدلات، الحمضات، والخلايا cytotoxic T، والأجسام الصباغية، وغيرها، SGs عرض ميزات الليزوزومية، وتصنف على أنها ذات الصلة يحلول العضيات (لروس) أو lysosomes الافرازية^30،31 . نظراً لروس درجة حموضة لومينال حمضية، يمكن استخدام فيتك-ديكستران لتصور هذه الرقابة، نتيجة لأعلى درجة الحموضة المرتبطة اكستيريوريزيشن من لروس. وفي الواقع، فيتك-ديكستران قد استخدمت لرصد الرقابة في الإشراف^18،،من³²³³. في هذا الأسلوب، فيتك-ديكستران هو إضافة إلى ثقافة الخلية، تناولت بالخلايا pinocytosis وفرزها إلى شركة SGs. كما في ليسوسوميس، مروي fluorescence فيتك في شركة SGs عندما يكونون داخل الخلية. بيد عند الانصهار سان جرمان مع غشاء البلازما وما يترتب عليها من التعرض إلى الوسط الخارجي، يستعيد فيتك-ديكستران الأسفار كارتفاع درجة الحموضة سان جرمان، السماح بتتبع الأحداث اكسوسيتيك بسيطة بخلية حية مجهرية. هنا، علينا تعديل هذا الأسلوب لتمكين تعقب فريدة من مجمع الرقابة.

طريقتين أخرى استخدمت سابقا لتتبع الرقابة المركبة. المجهر الإلكتروني هو الطريقة الأولى تميز الهياكل اكسوسيتيك التي اقترح حدوث أوضاع مختلفة للرقابة. على وجه الخصوص، أدت الملاحظات “أنفاق الافرازية” في البنكرياس خلايا أسينار³⁴ والإشراف^35،،من³⁶³⁷ إلى فرضية الرقابة مجمع. ولكن بينما دقة عالية من المجهر الإلكتروني لديه القدرة على الكشف عن حويصلات تنصهر فيها، لا تتبع ديناميات على الانصهار وبالتالي يتعذر تحديد ما إذا كان أنها مطابقة للانصهار سان جرمان خلال الرقابة مركب أو مزيج من حبيبات أعيد القبض عليهم بعد الالتقام بهم. هو التغلب على هذه العقبة في الأساليب الأخرى التي يمكن قياس الرقابة في الخلايا الحية، مثل تصحيح المشبك القياسات لغشاء البلازما السعة^11،13،،من³⁸³⁹ أو أمبيروميتري ⁴⁰ لوسائل الإعلام. ومع ذلك، لقط التصحيح يتطلب مجموعة خاصة وقد لا تكون مناسبة لجميع أنواع الخلايا. قياسات أمبيروميتري قادرين على تتبع الرقابة إلا إذا أفرج عن الشحنة في مقربة جداً من مسرى. ولذلك، استخدام التصوير خلية يعيش يقدم ميزة على هذه الأساليب، كما أنه لا يسمح لتتبع الوقت الحقيقي للرقابة، لكنه يسمح أيضا للحصول على البيانات من الخلية كلها سريعة وبسيطة.

تتبع فيتك-ديكستران بخلية حية مجهرية كما يوفر بعض المزايا للخلية الحية الأخرى الأساليب المستندة إلى التصوير. على سبيل المثال، أسلوب مستخدمة على نطاق واسع انعكاس الداخلية مجموع الأسفار مجهرية (تيرفم) من الخلايا محملة بتحقيق سان جرمان فلورسنت أو التعبير عن فلورسنت البروتين معلم سان جرمان البضائع أو الغشاء بروتين^{26،41، 42 , 43}-أن قوة هذا الأسلوب تكمن في قدرتها على رصد الأحداث التي تقع قريبا من غشاء البلازما (يشار إليها هنا “كالبصمة”)، حصرا ومن ثم أحداث اكسوسيتيك. ومع ذلك، يرجع هذا أيضا العائق من هذا الأسلوب سوى جزء الخلية المجاورة كوفيرجلاس وقريبة من عدسة مجهر يمكن تصويرها⁴⁴. فيما إذا كانت هذه البصمات تمثل الواقع على سطح غشاء الخلية كاملة من الجدل لا يزال^45،،من⁴⁶⁴⁷. وفي هذا الصدد، يسمح باستخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة مثل ديكستران فيتك ومجهر الأسفار قياسية أو مجهر [كنفوكل] مع ثقب مفتوحة تصوير الخلية كلها، ومن ثم التقاط اكسوسيتيك مجموع الأحداث التي تحدث في تلك الخلية.

وتشمل الصحفيين حساسة لدرجة الحموضة الإضافية التي يتم استخدامها لدراسة الرقابة الخاضعة للتنظيم بتصوير كل خلية أو تيرفم سان جرمان البضائع أو بروتين غشائي سان جرمان تنصهر إلى فلورين، متغير بروتينات فلورية خضراء حساسة لدرجة حموضة. وتشمل أمثلة نبي-فلورين-β-هيكسوسيمينيداسي-فلورين، وفلورين سينابتو^{48،49،50،،}من⁵¹⁵². وبينما قد تمثل التعبير عن هذه التحقيقات على نحو أوثق تكوين الذاتية SGs، تترتب عليها تعداء الخلايا، ولذلك قد تكون أقل ملاءمة للخلايا التي يصعب على ترانسفيكت. ولذلك، عند دراسة الخلايا التي يصعب ترانسفيكت أو تحت الظروف التجريبية التي تتطلب متعددة المعالجات الجينوم، استخدام مركب يمكن أن تستكمل ببساطة في مستنبت الخلية، مثل فيتك-ديكستران، من المفيد . فيتك-ديكستران كما يوفر ميزة على أكريديني البرتقالي (AO)، آخر صبغة حساسة لدرجة الحموضة التي تم استخدامها لتتبع الرقابة بخلية حية مجهرية^53،54،،من^{5556 , 57 , 58}-لقد ثبت AO للحث على التحلل حويصلات أن النتيجة في ومضات الزائفة، التي لا تتوافق مع إفراز الفعلية العمليات²⁷. وفي المقابل، يعكس فيتك-ديكستران الأحداث إفراز أفضل، ربما بسبب انخفاض الإنتاج الناجم عن صور من الأكسجين التفاعلية²⁷.

الجدير بالذكر نهج بديل لدراسة الرقابة عن طريق تتبع تدفق صبغة، من الوسط الخارجي إلى الأمين العام من خلال المسام الانصهار الذي يفتح خلال هذه العملية. وفي هذه الحالة، يتم إضافة الصبغة إلى الوسائط الخارجية جنبا إلى جنب مع المشغل الافرازية. ثم، عندما يفتح المسام الانصهار، ينشر الصبغة إلى^59،سان جرمان⁶⁰. ميزة واضحة من هذا الأسلوب أنه يوفر أيضا القدرة على تقدير حجم المسام الانصهار، باستخدام أصباغ حجم متغير. على سبيل المثال، يمكن استخدام ديكسترانس مختلفة الوزن الجزيئي (ميغاواط)، يضاف إلى فلوروفوريس مختلفة، الأصباغ خارج الخلية حيث أن تتوافق مع الحد الأقصى لحجم ديكستران التي يمكن أن تخترق سان جرمان حجم المسام الانصهار^{59، 61 , 62 , 63 , 64}-وبالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب هذا النهج استخدام مجس حساسة لدرجة الحموضة. ومع ذلك، عيب كبير أن إشارة إلى نسبة الضوضاء منخفضة جداً، نظراً لكمية كبيرة من صبغة موجود في وسائل الإعلام أثناء الحصول على الصور، أسفر عن خلفية عالية.

عموما، استخدام فيتك-ديكستران كعلامة للرقابة يتغلب على عيوب عدة أساليب سبق الإبلاغ عنها، مثل الإشارات الضجيج نسبة السمية والتعقب الدينامية والتعقيد.

هنا يصف لنا استخدام فيتك-ديكستران لرصد الرقابة مجمع في السطر 3 الصاري خلية ربل-2 ح (هذه الوثيقة المشار إليها ربل، المنشأة أساسا بواسطة اكليستون et al. ⁶⁵ واستنساخ المزيد من بارسوميان وآخرون ⁶⁶)، ردا على الغلوبولين المناعي ه (IgE)/التنشيط مستضد (Ag).

Protocol

1-الأعمال التحضيرية إعداد وسائط الثقافة ربل تعديل مزيج 500 مل من السكر منخفض دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) مع 56 مل مصل البقري الجنين (FBS)، 5.5 مل من محلول البنسلين-ستربتوميسين-النيستاتين، 5.5 مل من محلول مم 200 لتر-الجلوتامين. هذه النتائج في انخفاض الجلوكوز دميم تكملة مع 10% FBS، ستربتوميسي?…

Representative Results

ويمثل الشكل 1a تخطيطياً كيف ديكستران فيتك قد يعمل كمراسل لتنظيم الرقابة والخص أنماط مختلفة من الأحداث اكسوسيتيك. أولاً، هي المحتضنة الخلايا مع فيتك-ديكستران، استيعابه من بينوسيتوسيس وفرز لشركة SGs. منذ SGs MCs لروس، على درجة الحموضة منخفضة يقلل الأسفار فيتك، …

Discussion

هنا ونحن تصف كيفية تعقب يمكن استخدامها الأسفار من فيتك-ديكستران تحميلها في شركة SGs لالتقاط أحداث مجمع الرقابة على وجه التحديد. وكان ذلك عن طريق وضع المجهر الحصول على صورة كل 15 ثانية، مما يضمن أنه سيتم تسجيل الأحداث طويلة الأمد إلا مع مرور الوقت، وذلك باستثناء أحداث قصيرة يستجيب للرقابة الك…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67