FITC-Destrano di imaging come Reporter per esocitosi regolata

Summary

Qui abbiamo dettaglio un metodo per l’imaging di cellule vive di esocitosi regolata. Questo metodo utilizza FITC-Destrano, che si accumula in organelli lisosoma-correlati, come reporter. Questo semplice metodo permette anche di distinguere tra diverse modalità di esocitosi regolata in cellule che sono difficili da manipolare geneticamente.

Abstract

Esocitosi regolamentato è un processo mediante il quale carico, che è memorizzato nei granuli secretori (SGs), viene rilasciato in risposta a un trigger secretivo. Esocitosi regolata è fondamentale per la comunicazione intercellulare ed è un meccanismo chiave per la secrezione di neurotrasmettitori, ormoni, mediatori infiammatori e altri composti, da una varietà di cellule. Almeno tre meccanismi distinti sono noti per esocitosi regolata: esocitosi completo, dove un singolo SG si fonde completamente con la membrana plasmatica, bacio-e-faccia funzionare l’esocitosi, dove un singolo SG transitoriamente si fonde con la membrana plasmatica, e composto esocitosi, dove diversi SGs fusibile con a vicenda, prima o dopo la fusione di SG con la membrana plasmatica. Il tipo di esocitosi regolata intrapresa da una cella è dettato spesso dal tipo di trigger secretiva. Tuttavia, in molte cellule, un singolo trigger secretivo può attivare contemporaneamente più modalità di esocitosi regolata. Nonostante la loro abbondanza e importanza attraverso specie e tipi di cellule, i meccanismi che determinano i diversi modi di secrezione sono in gran parte irrisolti. Una delle sfide principali nell’investigare le diverse modalità di esocitosi regolata, è la difficoltà di distinguere tra di loro così come esplorare loro separatamente. Qui descriviamo l’uso di isotiocianato di fluorescina (FITC)-destrano come un reporter di esocitosi e live cell imaging, per distinguere tra le diverse vie di esocitosi regolata, concentrandosi su composto esocitosi, basata sulla solidità e durata degli eventi esocitica.

Introduction

Regolamentato l’esocitosi è il meccanismo principale da cui prontamente fatta carico viene rilasciato da una cellula secretiva in risposta a un trigger specifico. Il carico è pre-formato e sequestrato in vescicole secretorie, in cui è memorizzato fino a quando un trigger inoltra il segnale per il rilascio di contenuti la SGs. Diversi tipi di segnali possono derivare in diverse modalità di esocitosi regolata, o diverse modalità di esocitosi regolata può verificarsi contemporaneamente. Sono noti tre modalità principali di esocitosi regolata: esocitosi completo, che prevede la fusione completa di un singolo granello secretivo con la membrana plasmatica; bacio-and-run esocitosi, che comporta la fusione transitoria del granulo secretivo con la membrana plasmatica seguita da suo riciclaggio; ed esocitosi composto, che è caratterizzata dalla fusione di homotypic di diversi prima di SGs (cioè, granularità esocitosi) o sequenziale (cioè, esocitosi sequenza) alla fusione con la membrana plasmatica¹. Esocitosi composto è considerata la più ampia modalità di carico release², poiché permette la rapida secrezione di carico, comprese quelle provenienti da SGs che si trovano distale dalla membrana del plasma. Esocitosi composto è stato documentato in sia cellule esocrine ed endocrine^{3,4,5,6,7,8,9}, così come in cellule del sistema immunitario. In cellule immuni, come gli eosinofilo^10,11,12 e neutrofili¹³, esocitosi composto permette il rilascio veloce e robusto di mediatori che sono necessari per uccidere gli agenti patogeni d’invasione come batteri o parassiti. Mastociti (MCs) distribuire esocitosi composto per l’efficiente rilascio dei mediatori infiammatori pre-memorizzati durante la risposta immune innata, anafilassi e altre reazioni allergiche^{14,15,16 , 17}. Poiché le diverse modalità di esocitosi può accadere simultaneamente^18,19, è diventato una sfida per distinguere tra loro in tempo reale o per identificare i loro macchinari rispettivi fusione, quindi delucidamento i meccanismi di fondo.

Qui presentiamo un metodo, basato su cellule vive imaging della cella caricato FITC-Destrano, che permette l’inseguimento in tempo reale degli eventi di esocitica e la distinzione fra loro diverse modalità. In particolare, il nostro metodo consente il monitoraggio esclusivo composto esocitosi.

FITC-Destrano è un coniugato del fluoroforo pH sensibili FITC con il destrano del polisaccaride di glucano. Destrani fluorescente identificati sono stati indicati per entrare nella cellula di micropinocytosis^20,21 e Macropinocitosi^22,23. Come scomparti endocitico maturo lisosomi, è stato dimostrato che FITC-Destrano si accumula nel lisosoma senza apparente degrado. Tuttavia, poiché FITC è un fluoroforo altamente sensibili al pH²⁴, e il lume del lisosoma è acido, fluorescenza FITC-Destrano disseta dopo aver raggiunto il lisosoma²⁴. Così, che istituisce i destrani come lisosoma mirati carico, insieme con la sensibilità di pH del FITC, hanno posto le basi per l’utilizzo di FITC-Destrano negli studi del lisosoma esocitosi^{25,26,27 , 28 , 29}.

In diversi tipi cellulari, MCs, neutrofili, eosinofili, cellule di T citotossiche, melanosomi e altri, la SGs lisosomiali caratteristiche dell’esposizione e sono classificati come organelli lisosoma-correlati (LROs) o secretiva lisosomi^30,31 . Poiché LROs hanno un pH acido luminal, FITC-Destrano può essere utilizzato per visualizzare loro esocitosi, come risultato più alto pH connesso con l’esteriorizzazione della LROs. Infatti, FITC-Destrano è stato usato per monitorare esocitosi in MCs^18,32,33. In questo metodo, FITC-Destrano è aggiunto alla coltura delle cellule, preso dalle cellule di pinocitosi e ordinato in SGs. Come è nei lisosomi, fluorescenza FITC è spenta in SGs quando sono all’interno della cellula. Tuttavia, sulla fusione di SG con la membrana plasmatica e la conseguente esposizione all’ambiente esterno, il FITC-Destrano riacquista relativa fluorescenza come gli aumenti di pH di SG, permettendo che il semplice rilevamento di eventi esocitica da microscopia di cellule vive. Qui, abbiamo regolato questo metodo per abilitare il rilevamento univoco composto esocitosi.

Due altri metodi sono stati utilizzati in precedenza per tenere traccia di esocitosi composto. La microscopia elettronica è stato il primo metodo per la caratterizzazione di strutture di esocitica che ha suggerito l’avvenimento di diverse modalità di esocitosi. In particolare, le osservazioni di “tunnel secretiva” in cellule acinose pancreatiche³⁴ e MCs^35,36,37 ha dato luogo all’ipotesi di esocitosi composto. Tuttavia, mentre l’alta risoluzione di microscopia elettronica ha il potere di rivelare le vescicole fuse, non può tenere traccia le dinamiche della loro fusione e quindi non è possibile definire se essi corrispondono a fusione SG durante esocitosi composto o fusione di granuli riconquistate seguendo il loro endocitosi. Questo ostacolo è stato superato in altri metodi che possono misurare esocitosi in cellule viventi, quali misure del morsetto di toppa della membrana plasmatica capacitanza^11,13,38,39 o amperometria ⁴⁰ di media. Tuttavia, patch di bloccaggio richiede una speciale messa a punto e potrebbe non essere adatto per tutti i tipi di cellule. Amperometria misurazioni sono in grado di monitorare l’esocitosi solo se il carico viene rilasciato nella prossimità molto vicina all’elettrodo. Pertanto, facendo uso di live cell imaging offre un vantaggio rispetto a questi metodi, permette non solo di inseguimento in tempo reale di esocitosi, ma permette anche di semplice e rapida acquisizione di dati da tutta la cella.

Il tracking di FITC-Destrano da microscopia diretta cella offre anche alcuni vantaggi per altre cellule vive metodi basati su formazione immagine. Ad esempio, un metodo ampiamente utilizzato è la microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) di cellule caricate con una sonda fluorescente di SG o esprimendo una fluorescente proteina-etichetta SG cargo o membrana proteina^{26,41, 42 , 43}. la forza di questo metodo risiede nella sua capacità di monitorare esclusivamente gli eventi che si verificano vicino alla membrana plasmatica (in appresso come ingombro), quindi esocitica eventi. Tuttavia, questo è anche lo svantaggio di questo metodo, perché solo la frazione di cella che è adiacente il coprioggetto e vicino alla lente del microscopio può essere imaged⁴⁴. Se tali impronte rappresentano infatti la superficie intera membrana delle cellule è ancora discutibile^45,46,47. A questo proposito, utilizzando un colorante pH sensibili quali FITC-Destrano e un microscopio a fluorescenza standard o un microscopio confocale con un foro stenopeico aperto permette la formazione immagine della cella intera, catturando così il parete totale eventi che si verificano in quella cella.

Ulteriori reporter di pH sensibili che vengono utilizzati per studiare esocitosi regolata da formazione immagine intera cellula o TIRFM includono carico SG o proteina di membrana di SG fusa a phlourin, una variante GFP sensibili al pH. Gli esempi includono NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin e synapto-phluorin^{48,49,50,51,52}. Mentre l’espressione di queste sonde può rappresentare più da vicino la composizione endogena di SGs, esso comporta la transfezione delle cellule e può quindi essere meno adatto per le celle che sono difficili a transfect. Pertanto, durante lo studio delle celle che sono difficili a transfect o in condizioni sperimentali che richiedono più manipolazioni genomiche, l’uso di un composto che può essere semplicemente integrato nel terreno di coltura cellulare, ad esempio FITC-Destrano, è vantaggioso . FITC-Destrano offre anche un vantaggio sopra arancio di acridina (AO), un altro colorante di pH sensibili che è stato utilizzato per il rilevamento di esocitosi di cellule vive microscopia^{53,54,55,56 , 57 , 58}. AO è stato indicato per indurre la fotolisi di vescicole che risultato in lampi di falsi, che non corrispondono alla secrezione effettiva processi di²⁷. Al contrario, FITC-Destrano riflette meglio eventi di secrezione, probabilmente a causa della sua bassa produzione foto-indotta di ossigeno reattive²⁷.

In particolare, un approccio alternativo per lo studio di esocitosi è monitorando l’afflusso di un colorante, dal supporto esterno in SG attraverso il poro di fusione che si apre durante questo processo. In questo caso, il colorante viene aggiunto al mezzo esterno a fianco il grilletto secretivo. Poi, quando si apre il poro di fusione, la tintura si diffonde in SG^59,60. Un chiaro vantaggio di questo metodo è che esso offre anche la possibilità di stimare la dimensione dei pori di fusione, mediante l’uso di coloranti di dimensioni variabili. Ad esempio, destrani di diverso peso molecolare (MW), coniugati a fluorofori diversi, possono essere utilizzati come coloranti extracellulare, per cui la dimensione massima di destrano che possa penetrare la SG corrisponderebbe alla dimensione del poro fusione^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. Inoltre, questo approccio non richiede l’uso di una sonda di pH sensibili. Tuttavia, uno svantaggio significativo è che il rapporto segnale-rumore è molto basso, poiché una grande quantità di colorante è presente nei mezzi di comunicazione durante l’acquisizione delle immagini, con conseguente elevato background.

Nel complesso, l’uso di FITC-Destrano come indicatore per esocitosi supera diversi inconvenienti nei metodi precedentemente segnalati, come segnale/rumore rapporto, tossicità, tracciabilità dinamica e complessità.

Qui descriviamo l’uso di FITC-Destrano per monitorare composto esocitosi nella linea RBL – 2H 3 delle cellule di albero (di seguito definita come RBL, principalmente fondata da Eccleston et al. ⁶⁵ e ulteriormente clonato da Barsumian et al. ⁶⁶), in risposta all’immunoglobulina E (IgE) / attivazione dell’antigene (Ag).

Protocol

1. preparati Preparazione di terreni di coltura RBL Mix da 500 mL di glucosio basso Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) con 56 mL di siero bovino fetale (FBS), 5,5 mL di soluzione di penicillina-streptomicina-nistatina, 5,5 mL di soluzione di L-glutamina 200 mM. Ciò si traduce in glucosio basso DMEM completati con 10% FBS, 100 µ g/mL di streptomicina, 100 unità/mL di penicillina, 12 unità/mL nistatina e 2 mM L-glutammina. Filtrare i media utilizzando un filtro alto-vuoto di 0,22 µm …

Representative Results

Figura 1a rappresenta schematicamente come FITC-Destrano può agire come un reporter per regolato esocitosi e ricapitolare le diverse modalità di esocitica eventi. In primo luogo, le cellule vengono incubate con FITC-Destrano, che è interiorizzato dal pinocitosi e ordinato per la SGs. Poiché il SGs di MCs sono LROs, loro basso pH smorza la fluorescenza del FITC, mostrato qui granuli di colore nero (A-C, I). Quando le cellule sono innescate da un secretagog…

Discussion

Qui descriviamo come tracciatura la fluorescenza di FITC-Destrano caricato in SGs può essere utilizzata in particolare acquisire eventi composto esocitosi. Questo è stato ottenuto impostando il microscopio per acquisire un’immagine ogni 15 secondi, garantendo così che verranno registrati solo gli eventi di lunga durata nel tempo, e pertanto escluse brevi eventi che corrisponderebbero a esocitosi completo o bacio-and-run esocitosi. Per stabilire il metodo, abbiamo mostrato che atterramento delle isoforme Rab5 che sono …

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67