Imaging FITC-декстран репортером для регулируемых экзоцитоз

Summary

Здесь мы подробно метод для живых клеток изображений регулируемых экзоцитоз. Этот метод использует FITC-декстрана, который накапливается в связанных с Лизосома органеллы, как репортер. Этот простой метод также позволяет различать различные виды регулируемых экзоцитоз в клетках, которые трудно манипулировать генетически.

Abstract

Регулируемые экзоцитоз представляет собой процесс, по которому груз, который хранится в секреторных гранул (SGs), выпущен в ответ на триггер секреторной. Регулируемые экзоцитоз является основополагающим для межклеточные связи и является ключевым механизмом для секреция нейротрансмиттеров, гормоны, воспалительных посредников и других соединений, различных клеток. По крайней мере три отдельных механизмов известны для регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, где один SG полностью сливается с плазматической мембраны, поцелуй и побегите экзоцитоз, где один SG временно предохранители с плазматической мембраны, и составные экзоцитоз, где несколько SGs сливаются друг с другом, до или после сплавливания SG с плазматической мембраны. Тип регулируемого экзоцитоз, предпринимаемые ячейки часто продиктовано тип секреторной триггера. Однако многих клеток, секреторные один триггер может активировать несколько режимов регулируемых экзоцитоз одновременно. Несмотря на обилие и значение различных видов и типов клеток механизмы, которые определяют различные режимы секреции основном нерешенными. Одна из главных задач в расследовании различных режимов регулируемых экзоцитоз, является трудность проведения различия между ними, а также изучать их отдельно. Здесь мы описываем использование флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран как репортер экзоцитоз и живой клетки, воображения, чтобы различать разные пути регулируемых экзоцитоз, сосредоточив внимание на составные экзоцитоз, основанный на надежность и продолжительность события exocytic.

Introduction

Регулируемые экзоцитоз является основным механизмом, который легко сделал груза освобождается от секреторных клеток в ответ на конкретного триггера. Груз предварительно сформированы и поглощенных в секреторные пузырьки, в которых он хранится до тех пор, пока триггер передает сигнал для выпуска SGs содержание. Различные типы сигналов может привести к различных режимов регулируемых экзоцитоз, или различные виды регулируемых экзоцитоз может произойти одновременно. Известны три основных видов регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, который включает в себя полное слияние одного секреторных гранул с плазматической мембраны; поцелуй и побегите экзоцитоз, который включает в себя временные синтеза секреторных гранул с плазматической мембраны, следуют его переработки; и составные экзоцитоз, которая характеризуется homotypic слияние нескольких предварительного SGs (то есть, многогранулярную экзоцитоз) или последовательный (то есть, последовательные экзоцитоз) фьюжн с плазматической мембраны¹. Составные экзоцитоз считается самой обширной режим грузовой версии², как он позволяет быстро секрецию грузов, в том числе от SGs, которые расположены дистальной от плазматической мембраны. Составные экзоцитоз задокументировано как эндокринной и экзокринной клетки^{3,4,5,6,,78,9}, а также в иммунные клетки. В иммунных клеток, таких как эозинофилов^10,,1112 и нейтрофилы¹³составные экзоцитоз позволяет быстрый и надежный высвобождение медиаторов, которые обязаны убить вторжение патогенов, таких как бактерии и паразитов. Тучные клетки (MCs) развернуть составные экзоцитоз для эффективного выпуска предварительно воспалительных медиаторов во время врожденные иммунные реакции, анафилактический шок и другие аллергические реакции^{14,,1516 , 17}. Поскольку различные режимы экзоцитоз может происходить одновременно^1918,, он стал проблемой различие между ними в режиме реального времени или для определения их соответствующих фьюжн механизмов, поэтому изучение их основные механизмы.

Здесь мы представляем метод, основанный на живой клетки визуализации ячейки загружен FITC-декстрана, который позволяет реального времени отслеживания событий exocytic и различия между их различными способами. В частности наш метод позволяет эксклюзивные мониторинг соединения экзоцитоз.

FITC-декстран является конъюгата Флюорофор рН чувствительных FITC с глюкан полисахарид декстрана. Дневно обозначенные декстраны показали ввести в ячейку micropinocytosis^20,21 и макропиноцитозом^22,23. Как endocytic отсеков перерастет лизосомы, было показано, что FITC-декстран накапливается в Лизосома без явного ухудшения качества. Однако поскольку FITC рН высокочувствительных Флюорофор²⁴, и лизосомальных люмен является кислой, FITC-декстран флуоресценции утоляет по достижении Лизосома²⁴. Таким образом установление декстраны как Лизосома целевых груза, наряду с рН чувствительность FITC, заложили основу для использования FITC-декстрана в исследованиях Лизосома экзоцитоз^{25,,2627 , 28 , 29}.

В нескольких типов клеток, в том числе MCs, нейтрофилов, эозинофилов, цитотоксических Т-клеток, меланосомы и другие SGs отображения лизосомальных особенности и классифицируются как связанные с Лизосома органеллы (LROs) или секреторной лизосомы^30,31 . Так как LROs имеют кислый рН Люминал, FITC-декстран может использоваться для визуализации их экзоцитоз, вследствие более высоких рН, связанные с экстериоризации LROs. Действительно FITC-декстран был использован для мониторинга экзоцитоз в МКН^18,32,33. В этом методе FITC-декстран добавляется к культуре клетки, рассмотрены клетками Пиноцитоз и отсортированный в SGs. Как это лизосомы, FITC флуоресценции угасает в SGs, когда они находятся в пределах ячейки. Однако после SG сплавливание с плазматической мембраны и последующего воздействия внешней среды, FITC-декстран восстанавливает его флуоресценции SG повышением рН, позволяя простое отслеживание событий exocytic, микроскопия живой клетки. Здесь мы скорректировали этот метод, чтобы включить уникальный отслеживания составных экзоцитоз.

Два других метода ранее использовались для отслеживания составных экзоцитоз. Электронная микроскопия был первый метод для характеристики структур exocytic, которые предложили возникновение различных видов экзоцитоз. В частности замечания «секреторной туннелей» клеток поджелудочной железы ацинарной³⁴ и MCs^35,,3637 вызвал гипотеза составных экзоцитоз. Однако в то время как высокое разрешение электронной микроскопии имеет право раскрыть плавленого везикулы, он не может отслеживать динамику их синтеза и поэтому невозможно определить, соответствуют ли они SG фьюжн во время соединения экзоцитоз или фьюжн пойманных гранул после их эндоцитоз. Преодолеть это препятствие в других методах, которые можно измерить экзоцитоз в живых клетках, таких как патч зажим измерения плазматической мембраны емкости^11,13,,3839 или amperometry ⁴⁰ средств массовой информации. Однако пережатия патч требует специальной установки и не могут быть пригодны для всех типов клеток. Amperometry измерения имеют возможность отслеживать экзоцитоз, только если груз выпускается в непосредственной близости к электроду. Таким образом использование живых клеток предлагает преимущество над этими методами, как он позволяет не только реального времени отслеживать экзоцитоз, но он также позволяет быстро и просто приобретение данных из всей ячейки.

Отслеживания FITC-декстрана, микроскопия живой клетки также предлагает ряд преимуществ для других живых клеток изображений на основе методов. Например широко используемым методом является микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) клеток загруженных с флуоресцентного зонда SG или выражая флуоресцентный протеин тегами SG груза или мембранный белок^{26,41, 42 , 43}. сила этого метода заключается в его способность отслеживать только те события, которые происходят недалеко от плазматической мембраны (далее именуемая след), поэтому exocytic события. Однако это также недостаток этого метода, потому что только ячейки фракция, которая примыкает к coverglass и недалеко от Микроскоп объектив может быть воспроизведен образ⁴⁴. Представляют ли такие следы действительно поверхности всей клеточной мембраны является по-прежнему спорным^45,,46–⁴⁷. В этой связи с помощью РН чувствительных краска например FITC-декстран и стандартный флуоресцентным микроскопом или Конфокальный микроскоп с открытым отверстием позволяет изображений всей клетки, тем самым захватив всего exocytic события, которые происходят в этой ячейке.

Дополнительные pH фактора репортеров, которые используются для изучения регулируемых экзоцитоз клеточных изображений или TIRFM включают SG груза или SG мембранных белков сливается с phlourin, вариант GFP pH фактора. Примеры включают NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin и synapto-phluorin^{48,49,50,,5152}. В то время как выражение этих датчиков может представлять более тесно эндогенного состав SGs, это влечет за собой transfection клетки и поэтому могут быть менее пригодны для клеток, которые трудно transfect. Поэтому, когда изучение клеток, трудно transfect или в экспериментальных условиях, которые требуют нескольких геномной манипуляции, выгодно использовать соединение, которое может дополняться просто в среду культуры клеток, таких как FITC-декстрана, . FITC-декстран также предлагает преимущество над акридин оранжевый (AO), другой рН чувствительных краситель, используемый для отслеживания экзоцитоз живой клетки микроскопии^{53,54,55,56 , 57 , 58}. было показано, что АО побудить фотолиз везикулы, что результат в ложных вспышки, которые не соответствуют фактическим секрецию процессов²⁷. В противоположность этому FITC-декстран отражает лучше секрецию события, вероятно из-за его низкой фото индуцированной производства кислорода²⁷.

Примечательно альтернативный подход для изучения экзоцитоз является отслеживание приток красителя, с внешнего носителя в SG через поры фьюжн, который открывается во время этого процесса. В этом случае краситель добавляется к внешней среде наряду с секреторной триггера. Затем когда открывает поры фьюжн, краситель диффундирует в SG^59,60. Явным преимуществом данного метода является, что он также предлагает возможность оценить размер пор фьюжн, путем использования красителей переменного размера. К примеру декстраны разной молекулярной массы (МВт), конъюгированных с различными флуорофоров, может использоваться как внеклеточного красители, whereby максимальный размер декстрана, которые могут проникнуть SG будет соответствовать размеру фьюжн поры^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. Кроме того, этот подход не требует использования чувствительных рН зонд. Однако существенным недостатком является, что соотношение сигнал-шум является очень низким, поскольку большое количество красителя присутствует в средствах массовой информации во время приобретения изображений, что приводит к высокой фоновой.

В целом использование FITC-декстрана в качестве маркера для экзоцитоз преодолевает несколько недостатков в сообщалось ранее методы, такие как сигнал/шум соотношение, токсичность, динамическое отслеживание и сложности.

Здесь мы описываем использование FITC-декстран следить составные экзоцитоз в RBL – 2H 3 тучных клеток линии (далее именуемая RBL, главным образом установленные Экклстон et al. ⁶⁵ и далее клонирован, Barsumian и др. ⁶⁶), в ответ на иммуноглобулина Е (IgE) / Активация антигена (Ag).

Protocol

1. Подготовка Подготовка RBL культуры средств массовой информации Смесь 500 мл низкий глюкозы Дульбекко изменения среднего (DMEM) орла с 56 мл плода бычьим сывороточным (ФБС), 5,5 мл раствора пенициллина стрептомицином нистатин, 5,5 мл раствора L-глютамин 200 мм. Это приводит к низкой глюк?…

Representative Results

Рисунок 1a представляет схематично как FITC-декстран могут выступать в качестве репортера регулируется экзоцитоз, и охарактеризовать различные режимы exocytic событий. Во-первых клетки инкубируют с FITC-декстрана, который интернализации, Пиноцитоз и сортирую…

Discussion

Здесь мы описываем, как трассировка флуоресценции FITC-декстран загружается в SGs может использоваться для специально захвата составные экзоцитоз событий. Это было достигнуто, установив Микроскоп, чтобы получить изображение каждые 15 секунд, обеспечивая тем самым, что со временем будет за…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67