JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Published: June 21, 2018
doi:
10.3791/57949
, , , ,
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute,University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute,University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology,Stellenbosch University

Summary

Лист спрей масс-спектрометрия является метод прямого химического анализа, который минимизирует пробоподготовки и устраняет хроматографии, позволяя для быстрого обнаружения малых молекул из растительных тканей.

Abstract

Растения производят тысячи маленьких молекул, которые являются различными в их химических свойств. Масс-спектрометрия (МС) – это мощный метод для анализа метаболитов завод, потому что он обеспечивает молекулярным весом с высокой чувствительностью и специфичностью. Лист спрей MS это техника окружающего ионизации где растительной ткани используется для прямого химического анализа через электроспрей, устраняя хроматографии из процесса. Этот подход к выборки метаболитов для широкого круга химических классов позволяет обнаружить одновременно с нетронутыми растительных тканей, свести к минимуму количество пробоподготовки требуется. При использовании с высоким разрешением и точной массы MS, лист спрей MS облегчает быстрое обнаружение метаболитов интерес. Это также возможно для сбора тандем массового фрагментации данных с этой техникой, чтобы облегчить составные идентификации. Сочетание точных измерений массы и фрагментации является полезным в подтверждающие составного удостоверения. Лист спрей MS техника требует лишь незначительных изменений в источник ионизации наноспрей и является полезным инструментом для дальнейшего расширения возможностей масс-спектрометр. Здесь свежих листьев ткани из Sceletium tortuosum (Аизовые), традиционное лекарственное растение из Южной Африки, анализируется; многочисленные Мезембрин алкалоиды обнаружены с листьев спрей МС.

Introduction

Растения содержат широкий спектр малых молекул с различными химическими свойствами. MS – это мощный метод для анализа соединений растений, потому что он может предоставить элементарный композиции с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения и идентификации метаболитов1. Чаще всего MS выполняется растворителя извлечены образцы, которые разделены хроматографии до MS анализ1. Однако использование жидкостной хроматографии (LC) требует длительного анализа раз и часто ассоциируется с обширной выборки подготовка1. В отличие от прямой химический анализ нетронутыми тканей, который обходит хроматографии это очень быстрый метод, требующих минимальной образца подготовка2. Таким образом в случаях, где может быть неполученный хроматографического шаги, прямой химический анализ может быть весьма выгодным.

Типичный LC-MS для натуральных продуктов и метаболомики исследования опирается на длительных массового извлечения сушеных или замороженных растительных материалов, содержащих несколько тканей и клеток типа3. Кроме того прямой химический анализ, например MS обнаружения метаболитов из растительной ткани, можно изолировать типы клеток и избежать подготовки артефакты4. Лист спрей МС, также упоминается как ткани спрей5,6, является прямой окружающего ионизации MS метод, который требует по существу не образца подготовка5,7. Лист спрей, который МС тесно связана с бумаги спрей МС, окружающего ионизации технику с характеристиками электроспрей ионизации, которая позволяет для обнаружения аналитов, залегают на бумаге7. Несмотря на название, лист спрей MS для различных видов растительных тканей, не только листья и был продемонстрирован на фрукты, семена, корни, цветочные ткани и клубни, среди других,6,8,9 10,,1112. Техника способствует ионизации эндогенного фитохимические непосредственно из растительного сырья в масс-спектрометр для обнаружения8. Лист спрей MS также может предоставить информацию о пространственном распределении химических веществ в ткани различных типов растений13. Когда лист спрей MS сравнивается с жидкостной экстракции и LC-MS, результаты предполагают спрей листьев, MS позволяет для быстрого обнаружения поверхностных метаболитов из типов уникальных клеток например трихом13. Рисунок 1 иллюстрирует экспериментальной установки MS спрей листьев. Прямые электроспрей ионизации происходит после лишь незначительные источника изменения. Высокое напряжение применяется к заводе ткани через металлический зажим, производства спрей высоко заряженных капель, образуя Тейлор конус, который несет ионов на входе ионов электроспрей г-жа ионизация происходит от естественной жидкости завода или растворителя appl СВУ на поверхности растений. Заостренным кончиком на ткани облегчает электроспрей и может быть естественно происходя или созданного путем разрезания.

Лист спрей MS это быстрый метод для качественного и полуколичественного анализа нетронутыми растительных тканей, которые нашли утилита для широкого ряда приложений. Например этот метод был использован для обнаружения эндогенных соединений различать родственных видов и даже для оценки изменений в того же вида, выращиваемые в различных условиях. Предыдущие исследования показали этот подход путем измерения метаболитов в Бьютиберри (Callicarpa L.) 12 и американский женьшень (Panax quinquefolium L.) 6. в последнем примере, гинзенозиды, аминокислоты и олигосахариды могут быть обнаружены после смачивания ткани сырой женьшень. Диких и культивируемых американский женьшень были дифференцированы от клубней ломтиками6. Женьшень клубней целостность был грядущие спрей лист MS, что позволило за последующие инспекции морфологических и микроскопических6. Кроме того может быть также обнаружен экзогенных соединений на образцы растений. Количество пестицидов (ацетамиприд, дифениламина, уничтожения, linuron и ботвы) были обнаружены в кожуре или целлюлозно фрукты и овощи9. Хотя эти исследования и многие другие показали полезность листьев спрей MS для различных конкретных целей, подробный протокол уже не сообщалось ранее.

Здесь описание протокола не будет сосредоточена на оптимизации метода для конкретной ткани или соединения. Скорее, обнаружение алкалоидов Мезембрин из Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Аизовые) используется в качестве примера для обсуждения необходимости оптимизации мер, которые следует использовать при создании листа спрей MS эксперимент для видов, ткани, или Compound(s) в первый раз. S. tortuosum это сочные эндемик полузасушливых Karroo региона Южной Африки. Традиционной медицины Сан и общины кой кой народов, он был использован для аппетита и жажда подавления, а также его психотропных и обезболивающий эффекты14,15. В настоящее время стандартизированные экстракты используются для лечения психоневрологических и нейропсихологические расстройства16,17. Основных соединений интерес включают алкалоид Мезембрин и его производные, многие из которых также находятся в смежных видов Sceletium 15. Популяций диких и культивируемых S. tortuosum имеют переменную концентрации Мезембрин алкалоидов, представляя таким образом проблема контроля качества18. Метод для быстрого обнаружения Мезембрин алкалоидов, например лист спрей МС, может быть полезным в мониторинге Sceletium продукции. Потому, что ранее было не подробный визуальный экспериментальный протокол для листьев спрей MS технику, мы проиллюстрируем метод, с помощью примера S. tortuosumи описан ниже: модификация наноспрей источника, отбор и подготовка растительных тканей, приобретение данных, интерпретация результатов и оптимизации параметров MS.

Protocol

1. изменения наноспрей источник для листьев спрей MS Используйте измененный наноспрей источник для листьев спрей МС. Как не аэрогидродинамических компоненты необходимы для листьев спрей MS, измените источник, удалив LC зонд из источника. Соберите листьев спрей MS провод, который…

Representative Results

В 10 недель, листья после прорастания, свеже собранных выросли парниковых S. tortuosum были проанализированы лист спрей МС. Экспериментальный рабочего процесса для обнаружения метаболитов от S. tortuosum листья с помощью спрей листьев, которые MS проиллюстрирована на <str…

Discussion

Успешное использование этого протокола опирается на оптимизации различных шагов для видов растений, тип ткани и целевой compound(s) интерес. Параметры, указанные в настоящем Протоколе обеспечивают хорошей отправной точкой. Следующие экспериментальные решения должны быть изготовлены и ис?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Грант программы исследований генома растений NSF IOS-1238812 и докторантура стипендий в биологии IOS-1400818. Работа финансировалась Монсанто студенческих стипендий для Кэтрин а. Сэммонс. Программа Фулбрайта для африканских исследователя ученых (2017-2018 годы) поблагодарил за финансирование присуждена Nokwanda P. Makunga. Мы высоко ценим пожертвования наноспрей источник из Джессика Prenni и протеомики и метаболомики объекта в университете штата Колорадо.

Materials

Conn Pin Digi-Key elctronics  WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific  source to provide voltage 
small clamp Digi-Key elctronics  314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics  290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics  Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints 
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest – S. tortousum
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography – mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -. F., Wong, M. Y. -. M., Tang, H. -. W., Che, C. -. M., Ng, K. -. M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. . GNPS Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018)
  22. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  23. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  24. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  25. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  26. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?. Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  27. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  28. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  29. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

Leaf Spray Mass SpectrometryAmbient IonizationPlant MetabolitesSceletium TortuosumMesembrine AlkaloidsPesticidesSample PreparationNano Spray SourceContaminant IonsData File
check_url/it/57949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image